宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子標(biāo)志的初步研究.pdf

1、【目的】 1．檢測(cè)p16，eIF<,4>E，cIAP1，Dab2，F(xiàn)HIT,cFLIP等基因在宮頸癌中有否擴(kuò)增或丟失，找出與宮頸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子標(biāo)志。 2．檢測(cè)CDK4在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的蛋白表達(dá)情況，探討CDK4在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的意義及作用。 3．探討多重連接探針擴(kuò)增法(MLPA，Multiplex ligation dependent probeamplification)，以期在本實(shí)驗(yàn)室建立起這一

2、新技術(shù)。 注：本實(shí)驗(yàn)中所用宮頸癌標(biāo)本均為宮頸鱗癌，在文中均簡(jiǎn)稱宮頸癌。 【方法】 1．顯微切割及DNA提取 從新鮮宮頸癌標(biāo)本(2004年10月開始收集，于-80℃冰箱保存)和2004年的宮頸癌石蠟標(biāo)本中，篩選出15例進(jìn)行顯微切割和DNA提取。 新鮮標(biāo)本做冰凍切片，石蠟標(biāo)本切片并脫蠟，均用蘇木素輕染色，在倒置顯微鏡下找準(zhǔn)正常組織(間質(zhì))和癌組織的部位，進(jìn)行顯微切割，分別取正常組織和癌細(xì)胞群，用商用試

3、劑盒提取DNA。 2．PCR 擴(kuò)增靶基因 檢測(cè)的6個(gè)靶基因是p16(MTS1，多腫瘤抑制基因1)、eIF4E(真核細(xì)胞翻譯起始因子4E)、cIAP1(一種凋亡抑制因子)、Dab2(分裂原反應(yīng)性磷酸化蛋白基因)、FHIT(脆性組氨酸三聯(lián)基因)、cFLIP(細(xì)胞型Fas相關(guān)死亡區(qū)域蛋白樣β白介素-1 轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白基因，是一種凋亡抑制因子)。以各靶基因或靶基因的一個(gè)外顯子為模板設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。 3．掃描

4、分析，確定基因擴(kuò)增或丟失 運(yùn)用bandscan 4.3對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行灰度掃描，并用軟件SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，確定發(fā)生擴(kuò)增或丟失的基因或外顯子。 4．免疫組化檢測(cè)CDK4的表達(dá) 運(yùn)用免疫組化SP法檢測(cè)宮頸病變中CDK4的表達(dá)情況。檢測(cè)對(duì)象為2004年全年的宮頸石蠟標(biāo)本，包括19例慢性宮頸炎，15例低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)變(LSIL，包括 CIN Ⅰ)，41 例高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL，包

5、括CINⅡ，CINⅢ)，66例宮頸癌(squamous carcinoma of the cervix，SCC)。 5．MLPA方法學(xué)的建立 根據(jù)p16第2個(gè)外顯子序列設(shè)計(jì)兩條探針，每條探針包括兩段序列。一段與母板 DNA p16 第二外顯子序列互補(bǔ)，兩探針中的這一段可前后相鄰(沒有堿基空隙)地結(jié)合到模板上；另一段根據(jù)M13噬菌體序列所設(shè)計(jì)，不能結(jié)合到模板DNA上，僅作為PCR通用引物的結(jié)合依據(jù)。在實(shí)驗(yàn)中，先使兩條探針與

6、正常組織(血樣)DNA結(jié)合后，用DNA連接酶(T4 DNALigase,Ampligase Thermostale DNA Ligase，Taq DNA 連接酶)在合適條件下將兩探針連接，連接成線的探針數(shù)量代表p16基因拷貝數(shù)量；之后用連接產(chǎn)物做PCR反應(yīng)模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。 【結(jié)果】 1．癌組織的基因拷貝異常 在宮頸癌中，p16 exon1、eIF4E、cIAP1、Dab2均有不同程度的擴(kuò)增，癌組織和正

7、常組織中p16 exon1的拷貝數(shù)有差別，該基因在癌組織中的拷貝數(shù)較正常組織中的拷貝數(shù)明顯增加，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。eIF4E，clAP1 和 Dab2 在宮頸癌中的基因拷貝異常情況均與p16 exon1相同(P<0.05)。FHIT exon10和cFLIP則無明顯缺失或擴(kuò)增(P>0.05)。 2．CDK4 在宮頸癌及其前期病變中的表達(dá)升高 按照慢性宮頸炎、LSIL、HSIL、宮頸癌的順序，CDK

8、4 的陽(yáng)性表達(dá)率分別是21.1％(4/19例)、46.7％(7/15例)、73.2％(30/41例)、92.4％(61/66例)。各組CDK4陽(yáng)性表達(dá)率與宮頸癌組CDK4陽(yáng)性表達(dá)率的差異均具有極顯著性意義(P<0.01)。宮頸炎組與LSIL組、LSIL組與HSIL組相比較差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因?qū)m頸炎與LSIL絕大多數(shù)都可治愈，病變嚴(yán)重程度相似，故可將宮頸炎組與LSIL組合為一組，與HSIL組進(jìn)行雙側(cè)X<'2>檢驗(yàn)，結(jié)果

9、顯示CDK4 的陽(yáng)性表達(dá)率的差異亦具有極顯著性意義(P<0.01)。 3．MLPA 實(shí)驗(yàn) 以人的DNA做母板的情況下，T4 DNA Ligase 可將兩條探針連接起來，用Ampligase Thermostale DNA Ligase和Taq DNA 連接酶則不能將其連接。但在不用人的DNA做母板的情況下(用魚精DNA)，或不加母板的情況下(用水來補(bǔ)足連接體系)，用T4 DNA Ligase 仍可將這兩條探針連接起來。

10、 【結(jié)論】 1．p16 exon1在宮頸癌中的基因改變?yōu)閿U(kuò)增，這可以從另外一個(gè)角度解釋在宮頸癌中p16蛋白表達(dá)增加的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果從基因結(jié)構(gòu)的改變方面表明了p16可能可以作為宮頸癌發(fā)生發(fā)展的有用的分子標(biāo)志。 2．eIF4E、cIAP1、Dab2在宮頸癌中表現(xiàn)為擴(kuò)增，可以初步考慮把這3個(gè)基因作為宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子標(biāo)志。 3．FHIT exon10、cFLIP在宮頸癌中無明顯異常變化，提示FHIT

11、exon10與cFLIP 基因可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系不大。 4．CDK4蛋白在宮頸癌及宮頸癌前病變細(xì)胞中過表達(dá)，且CDK4的表達(dá)有隨宮頸癌的發(fā)生發(fā)展而逐漸增高的趨勢(shì)，說明CDK4可能促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，并提示CDK4可能是宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)較好的輔助診斷標(biāo)記。 5．在MLPA實(shí)驗(yàn)中，用T4 DNA Ligase 可將兩條探針連接起來。但母板存在與否，T4 DNA Ligase都可使兩條探針連接，表明 T4