RNA干擾Nodal基因?qū)θ宋赶侔┌┘毎鸐NK-45凋亡及血管生成的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建并鑒定Nodal基因的RNAi慢病毒表達載體，轉(zhuǎn)染人胃腺癌癌細胞MNK-45，沉默人胃腺癌癌細胞MNK-45中Nodal，探討Nodal基因?qū)θ宋赶侔┌┘毎鸐NK-45凋亡及血管生成的影響。
　　方法：1）針對Nodal mRNA設(shè)計合成3條siRNA，及設(shè)計1條陰性對照siRNA。退火形成雙鏈DNA，與熒光載體（GV248）連接，對構(gòu)建的3個重組質(zhì)粒進行DNA測序，如測定序列與目的序列一致，提示插入Nodal基因RNA

2、i序列正確。2）對重組慢病毒載體進行包裝及鑒定，對測序正確的菌液進行質(zhì)粒抽提并與3種質(zhì)粒載體（重組質(zhì)粒及pHelper1.0、pHelper2.0）共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染293T細胞后96h，熒光顯微鏡觀察細胞，測定病毒滴度。3）將慢病毒感染人胃腺癌細胞MNK-45。感染72h后，進行熒光倒置顯微鏡觀察感染效率。qPCR檢測Nodal基因的表達。4）shRNA慢病毒感染MKN-45細胞，培養(yǎng)5天后，使用eBioscience的凋亡檢測

3、試劑盒及流氏細胞儀檢測細胞凋亡情況。5）采用人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）三維培養(yǎng)法分析慢病毒感染MKN-45細胞培養(yǎng)上清對血管形成的影響。Cellomics儀觀察人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）血管面積、平均血管長度、平均血管寬度、血管節(jié)點數(shù)來評估血管生成情況。
　　結(jié)果：（1）重組慢病毒載體的測序：對構(gòu)建的3個重組質(zhì)粒進行DNA測序，測序結(jié)果顯示，測定序列與目的序列一致。提示插入Nodal基因RNAi序列正確。（2）重組慢病

4、毒載體的包裝及鑒定：將3種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染293T細胞后96h，熒光顯微鏡觀察細胞，見細胞生長良好，熒光強烈。測定病毒滴度為5×108TU/ml。（3）qPCR檢測RNA干擾后Nodal基因的表達：RNAi慢病毒感染后，MKN-45細胞Nodal基因的表達水平顯著下調(diào)。LV-NODAL-RNAi(44787-1)感染、LV-NODAL-RNAi(44789-1)感染分別下調(diào)了80.3％和84.9%。(4)RNA干擾Nodal基因?qū)KN-4

5、5細胞凋亡的影響:shRNA慢病毒感染MKN-45細胞，培養(yǎng)5天后，干擾組凋亡率與對照組比較明顯升高（P＜0.05）。(5)對體外HUVEC細胞血管生成的影響:96孔板中鋪Matrigel，用收集的目的細胞培養(yǎng)上清液重懸HUVEC細胞，鋪96孔板。培養(yǎng)后加入Calcein AM，室溫孵育。與對照組比較，實驗組血管生成主要相關(guān)參數(shù)中，血管面積、平均血管長度、平均血管寬度、血管節(jié)點數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：