阿薩希毛孢子菌生物膜形態(tài)學(xué)、耐藥機(jī)制和影響因素的研究.pdf

1、毛孢子菌屬于半知菌亞門，芽生菌綱，隱球酵母目，隱球酵母科。在自然界中廣泛存在，是口腔、皮膚、指甲的正常寄生菌。它可引起淺部感染，如毛發(fā)、指甲、皮膚的白毛結(jié)節(jié)病和免疫缺陷患者的系統(tǒng)性或播散性感染，主要見于惡性腫瘤、血液病、呼吸功能不全、慢性腎功能不全、糖尿病、肝硬化或艾滋病患者。其主要風(fēng)險(xiǎn)因素有：抗生素、腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、細(xì)胞毒性藥物的使用，和各種醫(yī)療設(shè)備的應(yīng)用如機(jī)械通氣、導(dǎo)尿術(shù)、靜脈插管、移植、手術(shù)操作或持續(xù)性腹膜透析等。目前

2、尚有關(guān)于健康者感染此病原菌導(dǎo)致系統(tǒng)性感染的報(bào)告。阿薩希毛孢子菌是其重要臨床致病菌。
　　 阿薩希毛孢子菌(asahii trichosporon，T.asahii)所致播散性毛孢子菌病的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，盡管使用抗真菌藥物，但感染仍持續(xù)存在。2006年Giovanni[8]等發(fā)現(xiàn)與浮游狀態(tài)的菌株相比，阿薩希毛孢子菌生物膜細(xì)胞對兩性霉素B、卡泊芬凈、伏立康唑和氟康唑的最低抑菌濃度(MICs)明顯增加，國內(nèi)李繼紅[9]等也發(fā)現(xiàn)固著相即

3、生物膜細(xì)胞的MIC比浮游相成倍提高。導(dǎo)致耐藥性增加的原因是什么?
　　 研究目的：
　　 1.本課題首先模擬體內(nèi)環(huán)境在常用醫(yī)學(xué)材料表面構(gòu)建阿薩希毛孢子菌(T.asahii)生物膜(biofilm,BF)模型，證明其存在并在倒置顯微鏡及掃描電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)形態(tài)特征，從形態(tài)結(jié)構(gòu)方面探索生物膜耐藥的機(jī)理。
　　 2.采用FDA/PI雙熒光染色和激光共聚焦顯微鏡相結(jié)合的技術(shù)以2μm為步距觀察阿薩希毛孢子菌生物膜在不同

4、時間菌的分布情況和成熟期不同層面生物膜菌分布和活性，分析其耐藥機(jī)制。
　　 3.初步觀察不同材料對阿薩希毛孢子菌(T.asahii)生物膜(biofilm,BF)形成能力的影響。
　　 研究方法：
　　 1.以來源于本院皮膚科臨床分離株阿薩希毛孢子菌株(BZP07002)1株為研究對象，在聚芳脂材料上構(gòu)建T.asahii生物膜模型，不同時間觀察其在倒置顯微鏡和掃描電鏡下的形態(tài)特征，并同時用XTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定

5、生物膜活性進(jìn)行定量分析。
　　 2.激光共聚焦顯微鏡下觀察經(jīng)FDA/PI染色生物膜不同時間菌分布和成熟期不同層面菌分布、活性及生物膜厚度。
　　 3.將聚芳脂(PAT)、聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)材料剪成1×1cm2大小，放入24孔板中構(gòu)建T.asahii生物膜模型，采用XTT法測定生物膜活性進(jìn)行定量分析，不同時間觀察T.asahii生物膜在倒置顯微鏡下的形態(tài)特征，將聚芳脂、聚苯乙烯上培養(yǎng)72h的生物膜在掃描電

6、鏡下觀察。
　　 結(jié)果
　　 1.T.asahii可在聚芳脂表面形成生物膜，其形成過程包括了真菌表面粘附、微菌落形成和生物膜成熟；鏡下T.asahii生物膜的孢子、菌絲、假菌絲等多種形態(tài)相互堆積纏繞，與基質(zhì)共同形成一個復(fù)雜的三維立體結(jié)構(gòu)。隨時間延長，生物膜活性不斷升高，XTT法和活菌計(jì)數(shù)結(jié)果呈正相關(guān)(r=0.936，P＜0.001)；
　　 2.隨時間延長，阿薩希毛孢子菌逐漸由散在粘附到聚集成團(tuán)塊，活菌和死菌的量

7、都增加；T.asahii生物膜不同層面的活性曲線坡度緩和，無明顯規(guī)律，生物膜的厚度為14.3μm到31μm不等。
　　 3.聚芳脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯3種材料上均能形成生物膜，且形成的生物膜廣泛，幾乎覆蓋整個材料表面，不同材料上形成生物膜的活性有差別(F=14.743，P＜0.01)，48h時活性由高到低為聚芳脂=聚氯乙烯＞聚苯乙烯。倒置顯微鏡和掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)聚芳脂、聚氯乙烯形成的生物膜可見孢子、菌絲、假菌絲結(jié)構(gòu)，聚苯乙烯上

8、形成以孢子為主要結(jié)構(gòu)的微生物群落。
　　 結(jié)論
　　 1.體外可形成T.asahii生物膜；T.asahii生物膜比其浮游狀態(tài)下具有更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)；
　　 2.隨時間延長T.asahii生物膜活性不斷增高，不同層面T.asahii生物膜的活性無明顯差異，分析細(xì)胞低生長率并非T.asahii生物膜的耐藥機(jī)制。
　　 3.T.asahii可在不同的材料上形成生物膜，但不同材料上形成生物膜的能力不同。聚芳脂、聚