三種氧化劑對阿薩希毛孢子菌生長發(fā)育影響的研究.pdf

1、研究背景：
　　 毛孢子菌屬于半知菌、芽生菌綱、隱球酵母目、隱球酵母科，在自然界中廣泛存在，是皮膚、口腔、指甲的正常寄生菌。它可引起淺部感染，如毛發(fā)、皮膚、指甲的白毛結(jié)節(jié)病和免疫缺陷患者的系統(tǒng)性或播散性感染，主要見于惡性腫瘤、呼吸功能不全、慢性腎功能不全、血液病、糖尿病、肝硬化或艾滋病患者。其主要風(fēng)險(xiǎn)因素有：抗生素、免疫抑制劑、腎上腺皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒性藥物的使用，以及各種醫(yī)療操作如機(jī)械通氣、靜脈插管、導(dǎo)尿術(shù)、器官移植、手術(shù)操作或

2、持續(xù)性腹膜透析等[1-4]。目前尚有關(guān)于健康者感染此病原菌導(dǎo)致系統(tǒng)性感染的報(bào)告[5-8]，阿薩希毛孢子菌是其重要致病菌。
　　 阿薩希毛孢子菌（Trichosporonasahii，y.asahii）所致播散性毛孢子菌病的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，盡管使用抗真菌藥物，但感染仍持續(xù)存在。由于該菌的致病機(jī)制、毒力基因與耐藥機(jī)制等方面的研究目前尚不清楚，且該菌對絕大多數(shù)的抗真菌藥均耐藥，一旦該菌在機(jī)體造成了播散性、系統(tǒng)性感染，死亡率很高[9]。

3、因此，探索該菌侵襲及感染機(jī)制，顯得尤為重要。目前，已經(jīng)用于臨床或正在研究的抗真菌藥物主要作用于真菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、線粒體、影響核酸和蛋白質(zhì)合成及功能[10、11]。在上述藥物中，有的藥物因耐藥或毒副作用在臨床應(yīng)用受到很大限制，個(gè)別新近上市的藥物價(jià)格太高病人難以接受。近年來，氧化應(yīng)激機(jī)制在抗真菌藥的研究方面受到關(guān)注。比如：白念珠菌的抗菌機(jī)制研究，通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)殺傷真菌是目前某些抗真菌藥物的作用機(jī)制之一[12-14]。真菌病原體侵入機(jī)

4、體后，首先面臨的是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的防御，誘導(dǎo)機(jī)體進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)。吞噬細(xì)胞釋放大量活性氧介質(zhì)(ROS)，包括過氧化氫、超氧陰離子、羥自由基、過氧化物等；ROS和其他細(xì)胞因子共同作用使被吞噬的病原真菌經(jīng)受致死性打擊，病原菌被清除[15]。ROS的損傷作用對清除病原菌極為重要，而病原菌通過形態(tài)改變耐受氧化損傷的能力增強(qiáng)可能導(dǎo)致其免疫逃逸。由此看來，利用ROS和氧化應(yīng)激反應(yīng)可能成為抗真菌的有效途徑之一。
　　 研究目的：
　　

5、 本課題應(yīng)用三種氧化劑模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激環(huán)境，分別在肉眼、光鏡、掃描電鏡下觀察H2O2、二酰胺和甲萘醌三種氧化劑對阿薩希毛孢子菌臨床分離株與環(huán)境分離株生長發(fā)育的影響。
　　 研究方法：
　　 1.以臨床分離株（菌株號：CBS2479）和環(huán)境分離株（菌株號：CBS8904）T.asahii（均購自荷蘭CBS公司）為研究對象，配制菌懸液，分別接種在加入不同濃度H2O2、二酰胺、甲萘醌的PDA混合培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，肉眼觀察三種

6、氧化劑對兩株菌菌落生長情況的影響，并與空白對照相比較。
　　 2.臨床分離株和環(huán)境分離株T.asahii分別接種在加入三種氧化劑與液體YPD混合培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)3天，乳酸酚棉藍(lán)染色觀察，光鏡下觀察形態(tài)變化，生長發(fā)育情況，并與空白對照相比較。
　　 3.把臨床分離株和環(huán)境分離株T.asahii分別接種在加入不同濃度三種氧化劑的PDA混合培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h，挑取一團(tuán)菌落，制成掃描電鏡標(biāo)本，在掃描電鏡下觀察形態(tài)變化，并與空白

7、對照相比較。
　　 結(jié)果：
　　 1.肉眼觀察，臨床分離株和環(huán)境分離株T.asahii在加入不同濃度梯度三種氧化劑的PDA混合培養(yǎng)基上生長情況不同，隨氧化劑濃度的增加，菌落直徑減小，當(dāng)氧化劑濃度增大到一定數(shù)值時(shí)，菌株不再生長，三種氧化劑對環(huán)境分離株的影響較大，同一氧化劑相同濃度條件下菌落直徑較臨床分離株小。
　　 2.光鏡觀察，不同濃度的三種氧化劑對臨床分離株和環(huán)境分離株T.asahii有明顯的影響，與空白對照相

8、比較，可見大量發(fā)育不全未著色發(fā)亮的小孢子以及細(xì)胞碎片，偶可見胞壁皺縮的較大孢子，幾乎未見菌絲，而空白菌株見許多菌絲；隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，發(fā)育不全的孢子未見明顯變化。
　　 3.掃描電鏡觀察，臨床分離株空白對照可見大量的菌絲，表面不光滑，有皺褶，直徑約2μm;環(huán)境分離株空白對照見大量鏈狀孢子、關(guān)節(jié)孢子，表面有絨毛，孢子直徑約3μm。三種氧化劑對兩株菌形態(tài)均有影響，臨床分離株出現(xiàn)部分菌絲胞壁破壞，胞質(zhì)外溢，菌絲表面皺褶消失、光滑，體積

9、縮小，偶可見整個(gè)菌絲完全被破壞。環(huán)境分離株出現(xiàn)胞壁凹陷、萎縮、破壞，胞質(zhì)外溢，表面絨毛消失。甲萘醌對兩株菌影響最大，二酰胺次之，H2O2最小。
　　 結(jié)論：
　　 氧化劑濃度越高，臨床分離株和環(huán)境分離株T.asahii數(shù)量越少，濃度達(dá)到一定數(shù)值后，兩株菌不再生長。三種氧化劑影響臨床分離株和環(huán)境分離株T.asahii的生長發(fā)育，有菌絲狀態(tài)轉(zhuǎn)為孢子狀態(tài)傾向，對環(huán)境分離株影響更大一些；三種氧化劑中，甲萘醌對兩株菌作用效果最強(qiáng)，