人外周血單核源樹突狀細(xì)胞在阿薩希毛孢子菌感染中作用的研究.pdf

1、目的：
　　阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T. asahii）是一種重要的條件致病性真菌，在免疫功能低下的人群中可引起嚴(yán)重的深部感染，導(dǎo)致播散性毛孢子菌病，其病死率高達(dá)77％。近年來，該病的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。既往研究發(fā)現(xiàn)T.asahii對(duì)目前大部分的抗真菌類藥具有一定的耐藥性，氟康唑、兩性霉素B單獨(dú)及聯(lián)合用藥治療失敗的案例已有報(bào)道。然而，目前 T.asahii感染的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，因此，了解機(jī)體

2、在T.asahii感染過程中參與的免疫應(yīng)答反應(yīng)，可能為進(jìn)一步研發(fā)有效的治療措施提供免疫學(xué)理論基礎(chǔ)。本研究通過構(gòu)建外周血單核源樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）與T.asahii體外共孵育模型，旨在觀察T.asahii對(duì)健康人外周血單核源DCs吞噬、表型CD80、CD86、CD83及功能的影響，初步探究DCs在T.asahii感染中可能發(fā)揮作用。
　　方法：
　　密度梯度離心聯(lián)合體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法獲得健康人外

3、周血單核源 DCs；不同濃度的熱滅活T.asahii孢子懸液與DCs共孵育24小時(shí)（DCs與T.asahii濃度比分別為1︰1、1︰5和1︰10），RPMI-1640及LPS刺激組分別作為空白對(duì)照組及陽性對(duì)照組。瑞氏-姬姆薩染色觀察實(shí)驗(yàn)組DCs對(duì)不同濃度T.asahii的吞噬率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組DCs表面共刺激分子CD80、CD86、CD83表達(dá)情況；雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)各組上清液中細(xì)胞因子IL-12、IL-1

4、0分泌情況；收集24小時(shí)后各組DCs與T淋巴細(xì)胞共孵育72小時(shí)（DCs與T細(xì)胞濃度比為1：10），MTT法檢測(cè)各組T淋巴細(xì)胞增殖率。
　　結(jié)果：
　　1. DCs誘導(dǎo)過程中的形態(tài)變化及鑒定
　　細(xì)胞培養(yǎng)的不同時(shí)期（第0天、3天、5天）觀測(cè)到了典型的DCs形態(tài)學(xué)特征，培養(yǎng)第5天的細(xì)胞表面表達(dá) CD11c（DCs特異性標(biāo)志）的比率達(dá)(97.57±1.11)%（n=3），CD11c+細(xì)胞表面共刺激分子CD80、CD86表達(dá)率

5、較低，CD83幾乎無表達(dá)，說明此時(shí)DCs大多數(shù)是未成熟DCs，且DCs活力＞95%，成功獲得后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需DCs細(xì)胞。
　　2. DCs受不同處理因素刺激24h后形態(tài)變化
　　不同濃度（DCs與T.asahii濃度比分別為1︰1、1︰5和1︰10）的熱滅活T.asahii孢子與DCs共孵育24小時(shí)后，與空白對(duì)照組相比，DCs鏡下形態(tài)發(fā)生顯著改變，細(xì)胞表面毛刺樣結(jié)構(gòu)明顯增多，形狀更加不規(guī)則，且T.asahii孢子濃度越高，DCs

6、細(xì)胞形態(tài)變化越明顯，但變化無LPS組明顯。
　　3.實(shí)驗(yàn)組DCs對(duì)不同濃度T.asahii的吞噬情況
　　共孵育30min時(shí)，鏡下即可見DCs對(duì)T.asahii孢子的吞噬現(xiàn)象，24h時(shí)參與吞噬的DCs數(shù)量增加，DCs內(nèi)吞噬的T.asahii孢子數(shù)增多，且吞噬率具有真菌濃度依賴性，各組間吞噬率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.各組DCs表面共刺激分子CD80、CD86、CD83表達(dá)情況
　　與不同濃度 T

7、.asahii孢子共孵育24h后，與空白對(duì)照組相比，DCs細(xì)胞表面共刺激分子CD80、CD86及CD83的表達(dá)升高，具有真菌濃度依賴性，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均低于LPS刺激組（P＜0.05）。
　　5.各組細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子IL-12、IL-10分泌情況
　　與不同濃度 T.asahii孢子共孵育24h后，與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中細(xì)胞因子IL-12、IL-10濃度明顯升高，具有真菌濃度依賴性，各組間差異有

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均低于LPS刺激組（P＜0.05）。
　　6.不同處理組DCs促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖能力
　　與不同濃度 T.asahii孢子共孵育24h后，與空白對(duì)照組相比，刺激指數(shù)（stimulation index,SI）明顯升高，具有真菌濃度依賴性，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均低于LPS刺激組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. DCs對(duì)T.asahii孢子具有較強(qiáng)的吞噬功能，參與了機(jī)體抗T.asahii