類子癇動物模型中炎性反應作用的研究.pdf

1、研究背景:
　　子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期特有疾病，是母胎發(fā)病率和死亡率的主要原因。臨床上，主要表現(xiàn)為母體高血壓、蛋白尿、水腫、伴有或不伴有多器官系統(tǒng)損傷，如腎臟、肝臟、血液系統(tǒng)等；同時，伴有或不伴有胎兒綜合征（包括胎兒宮內生長受限、胎兒宮內窘迫、羊水過少、圍產(chǎn)兒發(fā)病率和死亡率增高等）。
　　子癇是在子癇前期基礎上發(fā)生的不能用其它原因解釋的抽搐，其發(fā)生機制至今仍不明確。據(jù)報道，子癇在世界范圍內發(fā)病率約

2、為1.4％，在發(fā)達國家子癇導致的孕產(chǎn)婦死亡已很罕見，但在某些欠發(fā)達地區(qū)，子癇所致的孕產(chǎn)婦死亡率仍高達15%。終止妊娠通常是重度子癇前期/子癇的唯一有效治療方法。
　　盡管希波克拉底在公元前400年就對子癇進行了描述，但子癇的病因學研究進展緩慢。眾多學者在上世紀九十年代嘗試不同方法建立了子癇前期動物模型，而目前尚無子癇動物模型的相關報道，建立一個具備人類子癇基本特征的動物模型，將對這一疾病的病理生理學研究及探尋發(fā)病機制和有效的預防治

3、療方法具有重要的促進作用。
　　第一部分戊四氮誘導類子癇抽搐動物模型的建立
　　目的:
　　參照Faas等實驗方法利用極低劑量內毒素對妊娠中期大鼠尾靜脈注射的方法建立子癇前期動物模型，運用化學刺激（戊四氮腹腔注射誘導）的方法在子癇前期動物模型基礎上建立一個能夠模擬人類子癇發(fā)病特征的動物模型，對研究子癇發(fā)病機制、病理生理改變及探尋新的有效治療手段具有重要的意義。
　　材料與方法:
　　1、實驗動物及分組：

4、r>　　實驗動物：SPF級8-10周齡的SD雌性大鼠（約200-240g）購于廣東省實驗動物中心，經(jīng)過隔離檢疫并適應性喂養(yǎng)一周后按雌雄大鼠2:1進行合籠，次晨行陰道涂片，鏡檢發(fā)現(xiàn)精子者標記為妊娠第0天；
　　實驗分組：39只大鼠隨分為以下5組：
　　1)正常非孕對照組NP(n=6)；
　　2)正常妊娠對照組P（n=6）；
　　3)子癇前期模型組PE（n=8）；
　　4)類子癇模型組PE-PTZ(n=10)接

5、受戊四氮腹腔注射誘發(fā)抽搐；
　　5)硫酸鎂治療組 PE-PTZ-Mg(n=9)接受戊四氮腹腔注射誘發(fā)抽搐前及硫酸鎂治療。
　　2、子癇前期動物模型制作：參照Faas等人先前報道的實驗方法利用極低劑量內毒素（l.0 ug/kg體重，生理鹽水溶解配制稀釋為2m1）于大鼠妊娠第14天采用微量注射泵由尾靜脈緩慢泵入，建立子癇前期大鼠模型；正常非孕及正常妊娠對照組給予等量生理鹽水2ml尾靜脈注射。
　　3、類子癇動物模型制作：在

6、子癇前期動物模型基礎上大鼠妊娠第16、17、18天采用戊四氮（pentylenetetrazol, PTZ）腹腔注射的方法誘導抽搐發(fā)生，PTZ劑量通過查閱文獻及預實驗結果考慮致癇率及死亡率綜合因素，采用40mg/kg體重。子癇模型組在大鼠妊娠第16、17、18天給予戊四氮40mg/kg體重腹腔注射誘發(fā)抽搐，觀察大鼠抽搐生物學行為，觀察各組抽搐情況；
　　4、硫酸鎂對抽搐的預防作用：根據(jù)先前文獻經(jīng)驗，于妊娠第16、17、18天戊四氮

7、注射前20分鐘給予270mg/kg體重硫酸鎂腹腔注射，觀察各組抽搐情況；
　　5、抽搐行為學記錄：抽搐行為學分級參照Racine（1972）經(jīng)典分級：1級：靜止、凝視和咀嚼；2級：點頭、濕狗樣抖動及面部抽動；3級：一側前肢震顫；4級：站立、雙側前肢震顫及持續(xù)性點頭；5級：全身性強直—陣攣性發(fā)作。觀察時間給藥后30分鐘。記錄指標包括，（1）抽搐潛伏期：給藥后到發(fā)生1級抽搐的時間；（2）五級抽搐潛伏期：給藥后到發(fā)生5級抽搐的時間；（3

8、）非五級抽搐持續(xù)時間：對30分鐘內未發(fā)生強直—陣攣性抽搐的大鼠記錄其由開始1級抽搐到恢復平靜的時間；（4）五級抽搐時間：發(fā)生強直—陣攣性抽搐持續(xù)時間；（5）五級抽搐發(fā)生率：發(fā)生強直—陣攣性抽搐大鼠數(shù)量占組內實驗大鼠總數(shù)的百分比。
　　6、大鼠生理生化指標檢測：妊娠第6、11、14、15、18天上午9:00-12:00間通過無創(chuàng)尾套法測量大鼠血壓；妊娠第7、12、16、19天通過代謝籠收集大鼠24小時尿蛋白；非孕大鼠的相關生理指標監(jiān)

9、測時間點按同批次孕鼠的相應妊娠時間進行。妊娠第19天麻醉大鼠，取下腔靜脈血離心收集血清后全自動生化分析儀檢測谷草氨酸轉氨酶（AST）、谷丙氨酸轉氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）的水平。終止妊娠，剖宮取胎對仔鼠及胎盤進行計數(shù)稱重，記錄可見的吸收胚胎及畸形胎兒個數(shù)，對結果進行統(tǒng)計分析。
　　7、統(tǒng)計學分析：采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，S-W方法進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布計量資料用均數(shù)±標準誤（x± s)表示，計

10、數(shù)資料用百分數(shù)表示。各組間采用方差分析進行比較，方差齊性采用最小顯著性差異檢驗（LSD），方差不齊時采用Dunnett's T3檢驗。重復測量的方差分析(analysis of variance for repeated measures)用于分析血壓、尿蛋白指標；率的比較采用卡方檢驗或Fisher精確概率檢驗。 P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、大鼠抽搐行為學：
　　1)給予戊四氮腹腔注射后，各

11、組大鼠均表現(xiàn)出不同程度的癇樣抽搐發(fā)作行為，誘發(fā)抽搐時生物學行為符合Racine描述的抽搐分級：給予戊四氮腹腔注射后大鼠活動活躍，然后出現(xiàn)靜止、凝視，隨后開始表現(xiàn)為重復、刻板、持續(xù)性點頭、咀嚼、濕狗樣抖動，以及輕度驚厥，出現(xiàn)一側前肢震顫、雙前肢震顫、站立繼而可能出現(xiàn)全身性強直一陣攣性發(fā)作；
　　2)類子癇模型組抽搐潛伏期73.2±6.6 s，五級抽搐潛伏期275.4±35.0 s，五級抽搐時間41.0±3.5 s，非五級抽搐時間58

12、7.0±175.4 s，五級抽搐發(fā)生率7/10；
　　3)硫酸鎂治療組誘發(fā)抽搐的時間（181.5±15.4 s）較類子癇模型組（73.2±6.6 s）明顯延長（P<0.01），五級抽搐時間明顯縮短（26.7±4.4 vs.47.4±5.4 s, P<0.05），且五級抽搐發(fā)生率在妊娠第17、18天顯著降低（P<0.01）；
　　2、大鼠生理生化指標水平變化：
　　1)類子癇模型組血壓與PE模型組無顯著性差異（P<0.0

13、5），而較正常妊娠組和非孕組明顯增高（P<0.01）；24小時尿蛋白變化與子癇前期組相同；血清ALT及AST在類子癇模型組明顯增高（P<0.05），Cr和BUN濃度在各組間無明顯差異；
　　2)硫酸鎂治療組血壓、尿蛋白變化趨勢與類子癇模型組及PE模型組無顯著性差異（P>0.05）；ALT、AST均較類子癇模型組降低，胎盤仔鼠重量較類子癇模型組增高，胚胎吸收率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結論:
　　

14、1.成功在子癇前期模型基礎上通過戊四氮腹腔注射的方法誘導子癇前期大鼠抽搐，建立類子癇模型；
　　2.硫酸鎂治療后大鼠血壓、尿蛋白未出現(xiàn)明顯改變，但反映臟器功能指標明顯降低，妊娠結局部分改善。
　　第二部分類子癇抽搐動物模型中炎性反應的作用
　　目的:
　　在戊四氮誘導子癇動物模型基礎上，通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）研究炎性因子在動物模型中的變化，探討炎性反應與子癇抽搐發(fā)病的關系。
　　材料與方法:

15、>　　1、實驗動物及分組：
　　實驗動物：SPF級8-10周齡的SD雌性大鼠（約200-240g）購于廣東省實驗動物中心，經(jīng)過隔離檢疫并適應性喂養(yǎng)一周后按雌雄大鼠2:1進行合籠，次晨行陰道涂片，鏡檢發(fā)現(xiàn)精子者標記為妊娠第0天；
　　實驗分組：57只大鼠隨分為以下7組：
　　6)正常非孕對照組NP(n=6)；
　　7)非孕抽搐組NP-PTZ(n=8)接受戊四氮腹腔注射誘發(fā)抽搐；
　　8)正常妊娠對照組P（n=

16、6）；
　　9)正常妊娠抽搐組P-PTZ(n=8)接受戊四氮腹腔注射誘發(fā)抽搐；
　　10)子癇前期模型組PE（n=8）；
　　11)類子癇模型組PE-PTZ(n=10)接受戊四氮腹腔注射誘發(fā)抽搐；
　　12)硫酸鎂治療組 PE-PTZ-Mg(n=9)接受戊四氮腹腔注射誘發(fā)抽搐前及硫酸鎂治療。
　　2、動物模型制作：類子癇模型鼠制作處理如第一部分所述；正常妊娠抽搐組、子癇模型組在大鼠妊娠第16、17、18天，

17、及非孕抽搐組在相應天數(shù)給予戊四氮40mg/kg體重腹腔注射誘發(fā)抽搐，觀察大鼠抽搐生物學行為，觀察各組抽搐情況；硫酸鎂治療組于妊娠第16、17、18天戊四氮注射前20分鐘給予270mg/kg體重硫酸鎂腹腔注射，觀察各組抽搐情況；
　　3、抽搐行為學記錄：抽搐行為學分級參照Racine（1972）經(jīng)典分級。記錄指標包括，（1）抽搐潛伏期：給藥后到發(fā)生1級抽搐的時間；（2）五級抽搐潛伏期：給藥后到發(fā)生5級抽搐的時間；（3）非五級抽搐持續(xù)

18、時間：對30分鐘內未發(fā)生強直—陣攣性抽搐的大鼠記錄其由開始1級抽搐到恢復平靜的時間；（4）五級抽搐時間：發(fā)生強直—陣攣性抽搐持續(xù)時間；（5）五級抽搐發(fā)生率：發(fā)生強直—陣攣性抽搐大鼠數(shù)量占組內實驗大鼠總數(shù)的百分比。
　　4、大鼠血清炎性因子檢測：妊娠第19天麻醉大鼠，取下腔靜脈血離心收集血清后ELISA實驗方法檢測炎性因子TNF-α、IL-1β，血管生成因子sFlt-1、PlGF的血清表達水平，并進行統(tǒng)計分析。
　　5、統(tǒng)計學

19、分析：采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，S-W方法進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布計量資料用均數(shù)±標準誤（x± s)表示，計數(shù)資料用百分數(shù)表示。各組間采用方差分析進行比較，方差齊性采用最小顯著性差異檢驗（LSD），方差不齊時采用Dunnett's T3檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、大鼠抽搐行為學：給予戊四氮腹腔注射后，各組大鼠均表現(xiàn)出不同程度的癇樣抽搐發(fā)作行為，類子癇模型組抽搐潛伏期（73.2±

20、6.6 s）較正常妊娠抽搐組（107.0±7.4 s）及正常非孕抽搐組(122.5±10.4 s)明顯縮短（P<0.01），而五級抽搐潛伏期，五級抽搐時間，非五級抽搐時間及五級抽搐發(fā)生率無顯著性差異；硫酸鎂治療組誘發(fā)抽搐的時間（181.5±15.4 s）較類子癇模型組（73.2±6.6 s）明顯延長（P<0.01），五級抽搐時間明顯縮短（26.7±4.4 vs.47.4±5.4 s, P<0.05），且五級抽搐發(fā)生率在妊娠第17、18天

21、顯著降低（P<0.01）；
　　2、大鼠血清炎性因子變化：TNF-α, IL-1β, sFlt-1及PlGF濃度在類子癇組達最高，而硫酸鎂治療后明顯下降。硫酸鎂治療后 TNF-α, sFlt-1及PlGF均明顯降低，組間差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　1.在類子癇動物模型中觀察到子癇前期大鼠較正常妊娠及正常非孕大鼠抽搐閾值降低，硫酸鎂治療后，大鼠抽搐閾值增高；
　　2.子癇前期模型鼠炎性因子水平較正常妊娠及

22、正常非孕大鼠明顯升高，硫酸鎂治療后大鼠炎性因子均明顯降低。推測戊四氮誘發(fā)抽搐閾值的降低可能與炎癥反應的嚴重程度有關。
　　第三部分水通道蛋白（AQP4）在類子癇模型鼠海馬組織中的表達
　　目的:
　　水通道蛋白4（AQP4）是構成腦組織中水通道蛋白的主要成分，參與癇樣抽搐發(fā)病，通過免疫組化、western blot方法、熒光定量PCR方法研究AQP4在類子癇模型鼠海馬組織中的表達情況，探討其在子癇發(fā)病中的作用。

23、　　材料與方法:
　　1、實驗動物及分組
　　實驗動物：具體條件如第一、二部分所述。
　　實驗分組：34只大鼠隨機分為以下4組：
　　1）正常非孕對照組NP(n=8)；
　　2）正常妊娠對照組P（n=8）；
　　3）子癇前期模型組PE（n=8）；
　　4）類子癇模型組E(n=10)接受戊四氮腹腔注射誘發(fā)抽搐。
　　2、子癇前期及類子癇動物模型建立：具體條件如第一、二部分所述。
　　3

24、、取材：妊娠第19日過量麻醉處死實驗大鼠，采用斷頭法取得腦組織，冰上操作快速分離海馬組織，一側迅速放入液氮快速冷凍，隨后轉入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?；另一側放入中性福爾馬林固定用于制作蠟塊。
　　4、采用免疫組化對AQP4蛋白在海馬組織中進行定位及半定量檢測。熒光定量PCR法檢測海馬組織中AQP4的表達，采用相對定量方法比較經(jīng)過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品或內參樣品目標轉錄本之間的表達差異。Western blot法檢測海馬組織中AQP

25、4的表達，用Quantity One軟件對蛋白免疫印跡條帶進行分析，計算目的條帶和內參條帶灰度值的比值并進行比較。
　　5、統(tǒng)計學分析：采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，S-W方法進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布計量資料用均數(shù)±標準誤（x± s)表示，計數(shù)資料用百分數(shù)表示。各組間采用方差分析進行比較，方差齊性采用最小顯著性差異檢驗（LSD），方差不齊時采用Dunnett's T3檢驗。重復測量的方差分析(analysis of va

26、riance for repeated measures)用于分析血壓、尿蛋白指標；率的比較采用卡方檢驗或Fisher精確概率檢驗。 P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、大鼠海馬組織AQP4免疫組化結果顯示陽性染色呈棕褐或棕黃色，沿血管壁或者細胞膜分布。正常非孕鼠陽性染色顆粒較少見，正常妊娠組AQP4陽性染色相比非孕鼠增加，PE及類子癇模型鼠中表達明顯增多。
　　2、QPCR相對定量結果提示AQP4

27、在PTZ誘發(fā)抽搐大鼠海馬組織中的表達明顯升高，其中類子癇模型組、子癇前期組明顯高于正常妊娠組和非孕組（P<0.05），而正常妊娠組及非孕組間AQP4表達量無明顯差異（P>0.05）。
　　3、Western-blot灰度比值分析結果提示AQP4在正常妊娠和非孕組表達無明顯差異，而在子癇前期及類子癇模型組明顯升高（P<0.05）。
　　結論:
　　AQP4在類子癇大鼠及 PTZ誘發(fā)抽搐的大鼠海馬組織中的表達明顯增加，可能