ApoE和iNOS敲除小鼠子癇前期動(dòng)物模型的建立和胎盤(pán)功能異常的研究.pdf

1、子癇前期(pre-eclampsia，RE)是在妊娠20周后出現(xiàn)的以高血壓、蛋白尿和水腫為特征的妊娠期常見(jiàn)疾病，PE對(duì)母體和胎兒的健康造成較大的傷害，也是導(dǎo)致孕婦及圍生兒發(fā)病和死亡的主要原因之一。目前對(duì)子癇前期發(fā)病機(jī)制國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有較深較廣泛的研究并提出多種學(xué)說(shuō)，但任何一種學(xué)說(shuō)都不能完全解釋子癇前期的病因，在眾多的子癇前期的發(fā)病機(jī)制中，內(nèi)皮損傷學(xué)說(shuō)越來(lái)越受到重視，認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是子癇前期發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。前期研究表明血管活性物質(zhì)NO以

2、及血脂代謝異常和內(nèi)皮細(xì)胞功能異常有直接的關(guān)系。
　　本實(shí)驗(yàn)擬用和脂代謝密切相關(guān)的載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)及和NO相關(guān)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)敲除小鼠研究子癇前期的發(fā)病機(jī)制。具體包括以下幾個(gè)方面:首先通過(guò)ApoE基因敲除小鼠;iNOS基因敲除小鼠及ApoE、iNOS雙基因敲除小鼠嘗試建立子癇前期的動(dòng)物模型。其次用HE染色和透射電鏡

3、法觀(guān)察胎盤(pán)的病理變化和用Western Blot法檢測(cè)各組小鼠胎盤(pán)中和炎癥相關(guān)蛋白及和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而闡明ApoE和iNOS導(dǎo)致的胎盤(pán)結(jié)構(gòu)和功能的異常在子癇前期發(fā)病中的作用及可能機(jī)制。
　　第一部分ApoE基因和子癇前期發(fā)病的關(guān)系
　　第一節(jié)ApoE基因敲除小鼠子癇前期動(dòng)物模型的建立
　　目的:觀(guān)察ApoE基因缺失后孕鼠是否存在血壓升高，尿蛋白和胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限等子癇前期樣癥狀的表現(xiàn)。
　　方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4、:ApoE-/-(ApoE deficient homozygote，ApoE基因缺失純合子)小鼠和野生型小鼠(wildtype，WT)由南京模式動(dòng)物中心直接獲得，將ApoE-/-小鼠和WT小鼠交配得到ApoE+/-小鼠(ApoE deficient heterozygote，ApoE基因缺失雜合子)。根據(jù)基因型將21只孕鼠分為ApoE-/-組，ApoE+/-組和WT組（各組N=7）。實(shí)驗(yàn)前用PCR(polymerase chain r

5、eaction)法擴(kuò)增相應(yīng)的基因片段測(cè)各組小鼠的基因型;將相同基因型的小鼠交配后，于妊娠第19天小鼠眼球取血，酶標(biāo)法測(cè)定小鼠孕末期血脂:總膽固醇(total cholesterol，TC)，甘油三酯(triglyceride，TG)，低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)。從妊娠開(kāi)始每4天測(cè)量小鼠孕期尾動(dòng)脈收縮血壓，考馬斯亮蘭法從妊

6、娠第4天開(kāi)始每4天進(jìn)行孕鼠孕尿蛋白定量，于第19天剖宮產(chǎn)取出胎鼠稱(chēng)量胎鼠出生體重、胎盤(pán)重量比較各組小鼠孕期生理指標(biāo)的變化。
　　結(jié)果:①ApoE-/-組小鼠基因PCR擴(kuò)增顯示特征性片段，鑒定實(shí)驗(yàn)用小鼠基因?yàn)锳poE基因缺失純合子和雜合子;小鼠妊娠末期ApoE-/-組和WT組相比血清TC、TG、LDL明顯升高但HDL水平明顯下降(P＜0.05或0.01)。小鼠妊娠末期血壓(第12天129.3±15.7mmHg，第16天121.7±5

7、.8mmHg)升高及尿蛋白水平(455.3±107.2mg/L)高于WT小鼠(P＜0.05);胎鼠體重(1004±130mg)和胎盤(pán)重量(110±7.2mg)均小于WT組(P＜0.01)。②ApoE+/-組小鼠基因PCR擴(kuò)增顯示特征性片段;TG高于WT組(P＜0.05)，TC，HDL，LDL均沒(méi)有明顯改變(P＞0.05)。ApoE+/-組妊娠期血壓、蛋白尿及胎鼠體重和胎盤(pán)重量和WT組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:A

8、poE-/-小鼠出現(xiàn)子癇前期癥狀，ApoE在子癇前期的發(fā)病中起到重要作用。
　　第二節(jié) ApoE敲除小鼠胎盤(pán)炎癥及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化
　　目的:觀(guān)察胎盤(pán)凋亡及炎癥反應(yīng)的變化探尋其可能的發(fā)病機(jī)制。
　　方法:首先胎盤(pán)HE染色觀(guān)和透射電鏡方法觀(guān)察胎盤(pán)宏觀(guān)和微觀(guān)結(jié)構(gòu)變化;再用Western Blot法檢測(cè)胎盤(pán)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介-6(interleuki

9、n-6，IL-6)、核因子轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，和凋亡相關(guān)蛋白bax、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，BCL-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表達(dá)水平，觀(guān)察和比較三組小鼠胎盤(pán)炎癥反應(yīng)及凋亡情況。
　　結(jié)果:①HE染色觀(guān)察到ApoE-/-小鼠胎盤(pán)細(xì)胞的腫脹和壞死，電鏡下觀(guān)察胎盤(pán)絨毛血管內(nèi)皮與WT組相比有明顯細(xì)胞器形態(tài)改變和染色質(zhì)異

10、常。ApoE-/-妊娠鼠胎盤(pán)組織中炎癥相關(guān)因子IL-6(0.917±0.153)、TNF-α(0.453±0.020)、NF-κb(1.602±0.234)和凋亡相關(guān)蛋白Bax(0.789±0.149)、bcl-2(0.977±0.349)，Caspase-3(2.132±0.173)的表達(dá)以及Bax/bcl-2(0.897±0.301)比值均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)。②ApoE+/-組胎盤(pán)HE染色光鏡下觀(guān)察和電鏡下

11、觀(guān)察均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯異常。胎盤(pán)除TNF-α和表達(dá)高于WT組外，Bcl-2，TNF-α，Caspase3，IL-6、NF-κB表達(dá)和WT組沒(méi)有差異。
　　結(jié)論:ApoE小鼠胎盤(pán)部位的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡可能在子癇前期的發(fā)病中起到重要作用。
　　第二部分 iNOS基因與子癇前期發(fā)病的關(guān)系
　　目的:觀(guān)察iNOS基因缺失后孕鼠是否存在血壓升高，尿蛋白和胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限等子癇前期樣癥狀的表現(xiàn)。并觀(guān)察胎盤(pán)細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)探尋其可能

12、的發(fā)病機(jī)制。
　　方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:iNOS/-(iNOS deficient homozygote，iNOS基因缺失純合子)小鼠和WT小鼠由南京模式動(dòng)物中心直接獲得，將iNOS-/-小鼠和野生型小鼠(wildtype，WT)小鼠交配得到iNOS+/-小鼠（iNOS deficient heterozygote，基因缺失雜合子）。根據(jù)基因型將21只孕鼠分為iNOS/-組，iNOS+/-組和WT小鼠組（各組N=7）。實(shí)驗(yàn)前用PCR法檢

13、測(cè)小鼠基因型。將基因型相同的雌鼠和雄鼠交配后，從妊娠0天開(kāi)始每四天測(cè)量小鼠孕期尾動(dòng)脈收縮血壓，考馬斯亮蘭法從妊娠第4天開(kāi)始每4天進(jìn)行孕鼠孕尿蛋白定量，于第19天剖宮產(chǎn)取出胎鼠稱(chēng)量胎鼠出生體重、胎盤(pán)重量比較各組小鼠孕期生理指標(biāo)的變化。硝酸還原法測(cè)定小鼠血清和胎盤(pán)中NO濃度。胎盤(pán)HE染色和透射電鏡方法觀(guān)察胎盤(pán)宏觀(guān)和微觀(guān)結(jié)構(gòu)變化;用Western Blot法檢測(cè)胎盤(pán)TNF-α、IL-6、NF-κB和凋亡相關(guān)蛋白bax、 BCL-2、caspa

14、s-3表達(dá)水平，觀(guān)察和比較三組小鼠胎盤(pán)炎癥反應(yīng)及凋亡情況。
　　結(jié)果:①iNOS-/-組PCR擴(kuò)增顯示特征性片段，鑒定小鼠基因型為iNOS基因缺失純合子和雜合子。iNOS-/-小鼠孕期血壓尿蛋白水平，胎盤(pán)和胎鼠重量及血清胎盤(pán)NO水平和WT相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。iNOS-/-組電鏡下和HE染色均可見(jiàn)胎盤(pán)毛細(xì)血管增生。iNOS-/-組除了胎盤(pán)NF-κb的蛋白的表達(dá)高于WT組(P＜0.05)但TNF-α、bax、IL-6、caspase-

15、3表達(dá)及Bax/Bcl-2和WT組相比無(wú)明顯差(P＞0.05)。②iNOS+/-組PCR擴(kuò)增顯示特征性片段， iNOS+/-小鼠孕期血壓尿蛋白水平，胎盤(pán)和胎鼠重量及血清胎盤(pán)NO水平和WT相比也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。iNOS+/-組和WT相比電鏡下結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差別，除了Bcl-2表達(dá)高于WT組外(P＜0.05)。TNF-α、IL-6、NF-κB、Bax、caspase-3的表達(dá)和WT組相比無(wú)明顯差別。
　　結(jié)論:iNOS敲除小鼠沒(méi)有出現(xiàn)子癇

16、前期,iNOS基因和子癇前期之間沒(méi)有直接的聯(lián)系。
　　第三部分 ApoE和iNOS基因的相互作用及與子癇前期發(fā)病的關(guān)系
　　目的:觀(guān)察iNOS和ApoE基因都缺失后孕鼠是否發(fā)生血壓升高，尿蛋白和胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限等子癇前期樣癥狀的表現(xiàn)，并觀(guān)察胎盤(pán)凋亡及炎癥反應(yīng)探尋這兩種基因的聯(lián)合作用在子癇前期發(fā)病中的作用。
　　方法:ApoE和iNOS雙基因敲除小鼠由ApoE和iNOS單基因敲除小鼠，交配得到ApoE+/-I NOS+/

17、小鼠（雙雜合子小鼠），再進(jìn)一步雜交得到純合子ApoE-/-iNOS-/-小鼠(iNOS，ApoE雙基因敲除純合子小鼠);根據(jù)小鼠基因型分為ApoE-/-組，iNOS-/-組， ApoE-/-iNOS-/-和WT組各組(N=7)。PCR驗(yàn)證各組小鼠的基因型。實(shí)驗(yàn)前用PCR法擴(kuò)增相應(yīng)的基因片段測(cè)各組小鼠的基因型，酶標(biāo)法測(cè)定小鼠孕末期血脂，硝酸還原法測(cè)定小鼠血清和胎盤(pán)中NO濃度;將相同基因型的雌鼠和雄鼠交配后，從妊娠0開(kāi)始每4天測(cè)量小鼠孕期尾

18、動(dòng)脈收縮血壓，考馬斯亮蘭法從妊娠第4天開(kāi)始每4天進(jìn)行孕鼠孕尿蛋白定量，于第19天剖宮產(chǎn)取出胎鼠稱(chēng)量胎鼠出生體重、胎盤(pán)重量比較各組小鼠孕期生理指標(biāo)的變化。胎盤(pán)HE染色和透射電鏡方法觀(guān)察胎盤(pán)宏觀(guān)和微觀(guān)結(jié)構(gòu);用Western Blot法檢測(cè)胎盤(pán)腫瘤壞死因子TNF-α、IL-6、NF-κB，和凋亡相關(guān)蛋白bax、BCL-2、caspase-3表達(dá)水平，觀(guān)察和比較三組小鼠胎盤(pán)炎癥反應(yīng)及凋亡情況。
　　結(jié)果:①PCR擴(kuò)增片段證實(shí)為ApoE基因

19、敲除和iNOS基因敲除的特征片段，證實(shí)小鼠為ApoE和iNOS雙基因敲除小鼠。ApoE-/-iNOS-/-組血清血脂變化顯著TG、TC、LDL明顯升高而HDL則降低(P＜0.01); ApoE-/-iNOS-/-組TG、LDL水平高于和ApoE-/-組而HDL則有所下降(P＜0.05)。ApoE-/-iNOS-/-胎盤(pán)和血清NO濃度均低于ApoE-/-組(P＜0.05)。A poE-/-iNOS-/-組胎盤(pán)NO(10.5±1.9μmol

20、/g)血清NO濃度(14.2±1.6μmol/L)低于WT組和ApoE-/-組(VSWT:P＜0.01;V.SApoE-/-P＜0.05)。ApoE-/-iNOS-/-孕期血壓呈逐漸上升趨勢(shì)，血壓妊娠第4天血壓(117.9±13.4mmHg)就開(kāi)始高于WT組(P＜0.05)，隨著妊娠的發(fā)展血壓逐漸上升，且在孕末期高于ApoE-/-組(P＜0.05)。孕末期尿蛋白第（第12天432.7±63.56mg/L，第16天603±73.18mg/

21、L）高于WT（P＜0.05和P＜0.01），且高于ApoE-/-組(P＜0.05)。小鼠胎盤(pán)重量胎鼠體重不僅低于WT組(P＜0.01)，也低于ApoE-/-組(P＜0.05)。②ApoE-/-iNOS-/-組HE染色見(jiàn)胎盤(pán)有顯著胎盤(pán)細(xì)胞凋亡和毛細(xì)血管壁損傷，電鏡下見(jiàn)胎盤(pán)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡顯現(xiàn)象。炎癥相關(guān)蛋白:ApoE-/-iNOS-/-組IL-6(0.744±0.101)、TNF-α(0.683±0.102)、NF-κB(2

22、.376±0.259)的表達(dá)均明顯高于WT組(P＜0.01或P＜0.05)。ApoE-/-iNOS-/-組TNF-α、NF-κB的表達(dá)高于ApoE-/-組(P＜0.05)，但I(xiàn)L-6的表達(dá)低于ApoE-/-組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。凋亡相關(guān)蛋白:ApoE-/-iNOS-/-組胎盤(pán)Bax(1.692±0.214)、Bcl-2(0.405±0.099)、caspase-3(2.438±0.520)及Bax/Bcl-2(4.409±