2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:乙型肝炎病毒是世界上肝臟感染性疾病發(fā)生的主要原因。目前對于乙型肝炎病毒生命周期,新的治療藥物,疾病發(fā)生學(xué)等的研究都難以深入進行,主要原因在于缺乏理想的細胞模型和動物模型。為試圖解決此一問題,我們制備了人原代肝細胞并優(yōu)化其培養(yǎng)條件,然后將此人原代肝細胞和新鮮的人正常肝組織分別移植到NOD/SCID鼠的肝臟和腎包膜下以建立起人-鼠嵌合體肝模型小鼠,此動物體內(nèi)有正常的人肝細胞和肝組織。所以,用標準的人乙型肝炎病毒感染人原代肝細胞和此嵌合

2、體動物可建立起乙型肝炎細胞模型和動物模型。做為肝向載體的候選者,圍繞乙型肝炎病毒展開的研究已有十年之久。敲除了所有病毒開放讀碼框,并在S基因位置插入約800bp的報告基因。用此重組乙肝病毒載體感染人原代肝細胞和嵌合體動物,可確認其所攜帶的轉(zhuǎn)基因表達能力和特異定向能力。我們構(gòu)建的重組乙肝病毒載體為治療性載體的研究奠定了基礎(chǔ);所建立的細胞模型和動物模型也為乙型肝炎病毒研究的各個領(lǐng)域提供了有用的工具。 方法:(1)從臨床肝切除病人遺棄

3、肝組織獲取新鮮人正常肝組織,用改良的兩步膠原酶法分離人原代肝細胞,按1.0×10<'5> viable cells/cm<'2>的密度將細胞接種到膠原鋪被的培養(yǎng)瓶,先用含8﹪胎牛血清的培液,隨后換以不含血清培液。 (2)將要進行肝細胞移植的NOD/SCID鼠用retrorsine預(yù)處理,第二次注射retrorsine后4周備用。行50﹪肝切除,將5.0×10<'5>活細胞通過門靜脈注射方式進行移植;將1mm<'3>大小肝組織塊移

4、植到鼠。腎包膜下。通過ELISA法測動物血中hAAT水平以確定嵌合程度。 (3)為得到研究中所需標準乙肝病毒,構(gòu)建DNA載體MC2009,其中兩個標準野生型病毒基因組以頭尾連接方式相連,轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的人肝細胞中或通過注射進入鼠肝內(nèi)后可產(chǎn)生有感染能力的野生型病毒。 (4)為構(gòu)建以乙肝病毒為基礎(chǔ)的載體,首先構(gòu)建輔助質(zhì)粒MC2018,其中含有一個標準野生型病毒基因組,但消除了包裝信號ε和正向重復(fù)序列,其僅可以提供反式包裝所需各種

5、病毒蛋白,但不能組成一個完整乙肝病毒;同時構(gòu)建傳遞質(zhì)粒MC2013,其中以編碼綠色熒光蛋白基因的PCR片段取代S基因,以泛素啟動子取代病毒基因組序列中preS2/S啟動子,在其余病毒開放讀碼框上引入終止子,UB.eGFP表達盒的表達由CMV啟動子啟動。輔助質(zhì)粒MC2018和傳遞質(zhì)粒MC2013通過水流動力學(xué)注射的方法送到鼠肝內(nèi)包裝成重組乙肝病毒載體。 (5)用標準野生型病毒感染人原代肝細胞和嵌合體動物,實時熒光定量PCR測定HB

6、V DNA,ELISA法測定HBsAg。HE染色觀察細胞形態(tài),免疫熒光探查GFP/HBsAg表達,免疫組化確定HBsAg表達情況。 (6)用重組乙肝病毒載體感染人原代肝細胞和嵌合體動物,實時熒光定量PCR測定HBV DNA,ELISA法測定HBsAg,激光共聚焦和熒光探查GFP表達,流式細胞技術(shù)分析載體體外感染效率。 結(jié)果:每克肝組織平均人原代肝細胞產(chǎn)量為5×10<'5>細胞,細胞存活率為80﹪,12.4﹪為非實質(zhì)細胞,

7、其中包括2﹪枯否氏細胞,10.4﹪為肝竇上皮細胞,細胞在無血清培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10周以上。載體MC2009產(chǎn)生的標準HBV水平為3×10<'7>copies/ml,鼠體內(nèi)包裝產(chǎn)生的重組乙肝病毒載體水平為5×10<'6> copies/ml。5×10<'5>細胞通過門靜脈注射入9只經(jīng)retrorsine處理的NOD/SCID鼠肝內(nèi),1mm<'3>肝組織植入9只NOD/SCID鼠腎包膜下。門靜脈手術(shù)組5只動物存活,其中3只腹腔注射野生型HBV

8、, 2只腹腔注射重組乙肝病毒載體;腎包膜移植組動物5只腹腔注射野生型HBV,4只腹腔注射重組乙肝病毒載體。嵌合體鼠體內(nèi)hAAT濃度范圍在990 ng到33ng,嵌合體鼠經(jīng)腹腔注射野生型HBV后,血中HBV DNA水平為5×10<'3>copies/ml到0,HBsAg水平為0;而細胞培養(yǎng)基質(zhì)中HBV DNA水平可達10<'7>copies/ml,HBsAg水平為200 ng到770 ng。肝組織標本HE染色可見嵌合體動物中典型的人肝細胞

9、形態(tài),呈蒼白并有顆粒狀表現(xiàn);腎包膜下可見典型肝組織結(jié)構(gòu)。HBsAg免疫組化顯色呈陽性,免疫熒光探測HBsAg為陽性。用重組乙肝病毒載體感染人原代肝細胞和嵌合體動物,細胞培養(yǎng)基質(zhì)中HBV DNA僅在第三天可探測到10<'1>copies/ml,HBsAg水平為0。經(jīng)激光共聚焦可探測到細胞感染后第三天有GFP表達,第12天達高峰。感染重組病毒的動物血中僅在術(shù)后第三天可測到10<'1>copies/ml水平HBV DNA,HBsAg水平為0,

10、免疫熒光探測肝組織中GFP為陽性。 結(jié)論:(1)分離,培養(yǎng)了人原代肝細胞并優(yōu)化了培養(yǎng)條件,HBV可自然地有效地感染人原代肝細胞,因而成功建立了HBV感染的細胞模型。 (2)將人原代肝細胞移植到NOD/SCID鼠肝內(nèi),將人肝組織移植到鼠腎包膜下,建立了人-鼠嵌合體肝模型小鼠,并成功感染HBV,因而成功建立了HBV感染的動物模型。 (3)構(gòu)建了攜帶外源報告基因的重組乙肝病毒載體,此載體有800bp的可用空間,可成功特

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