孤啡肽受體拮抗劑對(duì)對(duì)機(jī)械性損傷神經(jīng)元存活率的影響.pdf

1、孤啡肽受體（orphanin receptor.ORL-1）是1994年發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性阿片肽受體，其在中樞和外周組織都有廣泛分布，并且參與機(jī)體的各項(xiàng)重要生理活動(dòng)調(diào)節(jié)。其內(nèi)源性配基孤啡肽（orphanin-FQ，OFQ）在第二年被發(fā)現(xiàn)，是目前發(fā)現(xiàn)的孤啡肽受體唯一的配基，在機(jī)體中同樣發(fā)揮著重要的功能。文獻(xiàn)顯示,創(chuàng)傷性腦損傷后孤啡肽（OFQ）的表達(dá)明顯升高,有學(xué)者推測(cè)，OFQ/ORL1系統(tǒng)可能在創(chuàng)傷性腦損傷后發(fā)揮重要的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在體外

2、原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)損傷模型的細(xì)胞培養(yǎng)液中給予孤啡肽受體阻斷劑（Nphe）的方法，研究了不同劑量的孤啡肽受體阻斷劑對(duì)機(jī)械性神經(jīng)元損傷的影響，并初步探討其可能的機(jī)制，為深入認(rèn)識(shí)OFQ/ORL1系統(tǒng)在創(chuàng)傷性腦損傷中的分子學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)一體外培養(yǎng)大鼠腦皮層神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型的建立
　　目的：驗(yàn)證細(xì)胞水平建立體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型，為下一步進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)損傷的分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：進(jìn)行胎鼠大腦

3、皮層組織神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)，并進(jìn)行觀察，神經(jīng)元成活1周，鑒定神經(jīng)元純化率后，用槍頭劃傷神經(jīng)元細(xì)胞造成損傷。觀測(cè)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)與存活率變化，并利用培養(yǎng)液乳酸脫氫酶活性變化反映細(xì)胞病理狀態(tài)，從而證實(shí)模型的效果。
　　結(jié)果：神經(jīng)元體外培養(yǎng)1周，光鏡下見(jiàn)細(xì)胞核大而清晰、透亮，圓形，核仁明顯。胞體呈多形性，胞質(zhì)透亮，細(xì)胞具有折光性，自胞體伸出較多突起，神經(jīng)元突起間相互聯(lián)系成網(wǎng)。NF200免疫組織化學(xué)染色細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)90％。機(jī)械性劃割后可見(jiàn)損傷

4、區(qū)神經(jīng)元立即壞死，細(xì)胞存活率下降，培養(yǎng)液乳酸脫氫酶活性升高。
　　結(jié)論：胎鼠大腦皮層組織體外原代培養(yǎng)生成的神經(jīng)元純化率較高，該模型是一種簡(jiǎn)單而有效的體外培養(yǎng)神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型。
　　實(shí)驗(yàn)二神經(jīng)元機(jī)械損傷后孤啡肽受體的表達(dá)及其拮抗劑Nphe對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用
　　目的：觀察體外實(shí)驗(yàn)中神經(jīng)元機(jī)械性損傷后ORL-1受體的表達(dá)和特異性阻斷其受體ORL-1能否對(duì)損傷的神經(jīng)元具有保護(hù)作用。
　　方法：神經(jīng)元機(jī)械性損傷后，通

5、過(guò)WesternBlot方法檢測(cè)ORL-1的表達(dá)，用其特異性阻斷劑（[Nphe1]-NC(1-13)-NH2,Nphe）阻斷OFQ受體ORL-1，通過(guò)乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性，MTT測(cè)定，研究損傷后對(duì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。
　　結(jié)果：體外培養(yǎng)神經(jīng)元機(jī)械性損傷后，神經(jīng)元機(jī)械性損傷后，觀測(cè)不同劑量Nphe處理LDH值的變化，測(cè)定了各處理組在不同時(shí)間點(diǎn)（30min,1h,3h,6h,12h,2

6、4h,48h）的LDH活性，提示Nphe能夠減少LDH數(shù)值，并存在劑量依賴(lài)性。損傷后12h，損傷后通過(guò)MTT測(cè)定細(xì)胞存活率，對(duì)照組和不同劑量Nphe處理組的細(xì)胞存活率分別為36％和49％、58％、65％、72％、80％、84％、85％，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（P<0.05）,且存在劑量依賴(lài)性。Western Blot方法檢測(cè)ORL-1表達(dá)水平無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：ORL-1在神經(jīng)元機(jī)械性損傷后持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，其特異性阻斷劑Nphe能夠減

7、少機(jī)械性損傷后繼發(fā)性神經(jīng)元損害，對(duì)神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用，OFQ/ORL-1系統(tǒng)可能在創(chuàng)傷性腦損傷中發(fā)揮著一定作用。
　　實(shí)驗(yàn)三Nphe對(duì)神經(jīng)元機(jī)械損傷后的保護(hù)作用機(jī)理初步研究
　　目的：Nphe對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用已經(jīng)被證明，但其具體的作用機(jī)理尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了神經(jīng)元機(jī)械損傷后細(xì)胞內(nèi)Ca2+，Caspase-3含量變化。
　　方法：神經(jīng)元機(jī)械性損傷后，用ORL-1的特異性阻斷劑（[Nphe1]-NC(1-13)-