DZX調(diào)控lncRNA S66184對(duì)損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用.pdf

1、缺血性腦血管病以其發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高的特點(diǎn)嚴(yán)重影響了人民的生命健康和生活質(zhì)量，給社會(huì)和家庭造成沉重的負(fù)擔(dān)。缺血再灌注（I/R）引起神經(jīng)元凋亡是導(dǎo)致腦組織損傷的主要原因。而線粒體ATP敏感性鉀通道（KATP）開放劑二氮嗪（DZX），能夠降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，對(duì)神經(jīng)元的損傷有保護(hù)作用。目前二氮嗪（DZX）在保護(hù)神經(jīng)元上的分子機(jī)制尚不明確。因此，本課題通過(guò)細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)試圖探究二氮嗪（DZX）對(duì)神經(jīng)保護(hù)的分子機(jī)制。
　　目的

2、：
　　第一部分探索ATP敏感K通道基因表達(dá)與腦神經(jīng)元損傷之間的關(guān)系，試圖對(duì)KATP通道開放劑DZX治療腦神經(jīng)元損傷的相關(guān)基因及其可能的下游靶標(biāo)進(jìn)行觀察。
　　第二部分探索ATP敏感鉀通道開放劑DZX作用對(duì)氧糖剝奪引起的海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，試圖說(shuō)明DZX減少神經(jīng)凋亡的作用和機(jī)制。
　　第三部分探索ATP敏感鉀通道開放劑DZX對(duì)缺血再灌注中大鼠神經(jīng)損傷的保護(hù)作用。
　　第四部分尋找 DZX與下游靶分子之間存在

3、 lncRNAs“橋梁”分子，并研究它們之間調(diào)控關(guān)系，進(jìn)一步說(shuō)明DZX對(duì)損傷神經(jīng)元有保護(hù)作用。
　　方法：
　　第一部分通過(guò)生物信息學(xué)分析在腦缺血再灌注中 ATP敏感性鉀通道差異表達(dá)的基因；對(duì)海馬腦片進(jìn)行氧糖剝奪處理：進(jìn)一步應(yīng)用膜片鉗檢測(cè)不同藥物預(yù)處理海馬腦片氧糖剝奪模型后，海馬神經(jīng)元KATP通道電流的變化。
　　第二部分通過(guò)分離培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，構(gòu)建氧糖剝奪的海馬神經(jīng)元細(xì)胞和腦片模型；應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光法、MTT法、LD

4、H測(cè)定法、TUNEL染色法來(lái)鑒定模型構(gòu)建情況；對(duì)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行不同處理，分為：NC組，OGD組，DZX+OGD組， DZX+5-HD+OGD組， TG+DZX+OGD組，用流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)各組的海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率。和應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)法檢測(cè)在不同藥物作用下氧糖剝奪的海馬神經(jīng)元細(xì)胞和腦片中凋亡相關(guān)基因 caspase3,caspase12,Bax表達(dá)的改變情況。
　　第三部分采用線栓塞法構(gòu)建缺血再灌注大鼠模型，采用

5、腦立體定位側(cè)腦室注射法給藥，TTC染色法鑒定模型構(gòu)建情況；應(yīng)用神經(jīng)功能缺損評(píng)分了解神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度；對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行不同處理分為以下四組：假手術(shù)組，DZX+I/R組，DZX+5-HD+ I/R組，DZX+ TG+I/R組，對(duì)經(jīng)過(guò)不同處理大鼠應(yīng)用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力；應(yīng)用TTC染色法檢測(cè)大鼠腦梗死面積變化情況；應(yīng)用HE染色法檢測(cè)大鼠腦梗死面積的組織學(xué)變化情況和應(yīng)用TUNEL檢測(cè)法檢測(cè)大鼠腦組織細(xì)胞凋亡變化情況。
　　第四

6、部分通過(guò)lncRNA芯片分析尋找DZX與下游靶分子之間存在lncRNAs“橋梁”分子；缺血再灌注模型大鼠分為假手術(shù)組、I/R組、 DZX+I/R組、DZX+5-HD+ I/R組，DZX+ TG+I/R和 DZX+5-HD+ TG+ I/R組，各組應(yīng)用RT-PCR驗(yàn)證差異基因，發(fā)現(xiàn)lncRNA S66184的表達(dá)與DZX密切相關(guān)；構(gòu)建氧糖剝奪的海馬神經(jīng)元細(xì)胞模型，應(yīng)用lncRNA過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)及RT-PCR技術(shù)，驗(yàn)證DZX對(duì)lncRNA

7、S66184的調(diào)控關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　第一部分：
　　1.通過(guò)GSE23160芯片分析挖掘出與腦缺血再灌注大腦皮層（Cortex）和腦紋狀體（Striatum）中KATP敏感表達(dá)異常的基因，其中有7個(gè)差異基因同時(shí)存在皮質(zhì)和紋狀體中，這7個(gè)基因是 GPR84、GJB2、DSCR1、TLR2、GPR84、GJB2、CDKN1A。在腦缺血再灌注24小時(shí)內(nèi)表達(dá)量顯示：皮質(zhì)中KATP敏感基因GPR84、GJB2、DSCR1、

8、TLR2、GPR84、GJB2隨著腦損傷程度的增加（及缺血時(shí)間的增加）而增加；CDKN1A在缺血再灌注8小時(shí)的時(shí)候表達(dá)量達(dá)到最大，隨后隨缺血再灌注時(shí)間的增加下降；在腦缺血再灌注24小時(shí)內(nèi)紋狀體中KATP敏感基因 GPR84、GJB2、TLR2、GPR84、GJB2隨著腦損傷程度的增加（及缺血時(shí)間的增加）而增加；DSCR1、CDKN1A在8小時(shí)的時(shí)候達(dá)到最高狀態(tài)，隨后隨缺血再灌注時(shí)間的增加下降。
　　2.觀察神經(jīng)元KATP通道電流變

9、化的膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OGD組電流顯著升高表明造模成功。相對(duì)正常組KATP電流密度（53.3±5.3），OGD組的電流密度（93.2±5.4）顯著增高，DZX+OGD組的電流密度恢復(fù)到正常組大小（53.2±3.0），DZX+5-HD+OGD組（83.4±4.8）升高表明5-HD部分抑制DZX的神經(jīng)保護(hù)作用。TG+DZX+OGD組的KATP通道電流密度為（66.9±11.1），明顯低于OGD組，但與DZX+OGD組相比稍高，這表明DZX

10、可部分抑制ERS通路從而對(duì)OGD引起的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用。
　　第二部分：
　　1.原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)及鑒定：培養(yǎng)72h可見神經(jīng)元伸出的多個(gè)突起進(jìn)一步伸長(zhǎng)，可觀察到突起末端的生長(zhǎng)錐，還常見到多個(gè)神經(jīng)元聚集在一起，向四周發(fā)出樹枝狀神經(jīng)突起，形成稀疏的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，突起延長(zhǎng)增粗，網(wǎng)絡(luò)變得稠密，神經(jīng)元胞體逐漸增大。用FITC標(biāo)記的MAP2和PE標(biāo)記的Tau-1抗體染色鑒定神經(jīng)元，Hoechst33258染細(xì)胞核，熒光

11、顯微鏡下觀察神經(jīng)元樹突被染上了綠色，軸突染上紅色，細(xì)胞核染上藍(lán)色。以上結(jié)果證明通過(guò)原代培養(yǎng)所得到的細(xì)胞確實(shí)是海馬神經(jīng)元細(xì)胞。
　　2. MTT檢測(cè)氧糖剝奪后海馬神經(jīng)元細(xì)胞的活性：經(jīng)氧糖剝奪處理后，與正常組相比，氧糖剝奪處理組中海馬神經(jīng)元細(xì)胞的吸光值明顯下降，說(shuō)明活細(xì)胞的數(shù)量再減少。而且隨著氧糖剝奪后時(shí)間的延長(zhǎng)，死亡的海馬神經(jīng)元細(xì)胞越多。
　　3. LDH釋放量的測(cè)定：經(jīng)氧糖剝奪后，與正常組相比，氧糖剝奪組中海馬神經(jīng)元細(xì)胞LD

12、H的釋放量比正常細(xì)胞顯著增大，而且隨著氧糖剝奪后時(shí)間的延長(zhǎng)，釋放的LDH越來(lái)越多，說(shuō)明死亡的海馬神經(jīng)元細(xì)胞也越來(lái)越多。
　　4.大鼠海馬腦片氧糖剝奪模型用 TUNEL染色方法鑒定：與正常組相比，氧糖剝奪組中有大量的染色成棕色的陽(yáng)性細(xì)胞，說(shuō)明在氧糖剝奪模型組中有大量凋亡的細(xì)胞出現(xiàn)。成功構(gòu)建了大鼠腦片的氧糖剝奪模型。
　　5.流式檢測(cè)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡情況：與NC相比，OGD組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡顯著增多。DZX+OGD組海馬

13、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比 OGD組凋亡率明顯減少。DZX+5-HD+OGD組中海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率比DZX+OGD組顯著增加，但是還是比OGD組中海馬神經(jīng)元的凋亡率要低。TG+DZX+OGD組中海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率比DZX+OGD組顯著增加，但是還是比 OGD組中海馬神經(jīng)元的凋亡率要低。該結(jié)果表明鉀離子通道開放劑能抵抗由ERS引起的海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。
　　6. RT-PCR檢測(cè)凋亡密切相關(guān)基因：與正常對(duì)照組相比，模型組中Bax，

14、 Caspase-3，Caspase-12的表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組中，用DZX處理后，Bax， Caspase-3，Caspase-12的表達(dá)量顯著減少。當(dāng)用鉀離子通道阻斷劑5-HD和ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素TG和DZX一起處理大鼠海馬神經(jīng)元OGD和大鼠海馬腦片OGD模型后，Bax，Caspase-3，Caspase-12的表達(dá)量與DZX+OGD組相比又顯著增加，但又低于模型組。這些結(jié)果顯示DZX能保護(hù)腦組織，緩解細(xì)胞凋亡。
　　

15、第三部分：
　　1.線栓塞法腦缺血模型后24小時(shí)后，與正常組相比，取材后發(fā)現(xiàn)在腦缺血模型組中可見明顯的腦梗死部分。因此認(rèn)為用線栓塞法已經(jīng)成功構(gòu)建了腦缺血模型。
　　2.各組大鼠平臺(tái)逃避潛伏期的比較：在大鼠建模完成后，開始進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，第1天假手術(shù)組潛伏期為24.8±4.12s，而I/R模型組大鼠的潛伏期明顯延長(zhǎng)為79.5±6.33s， DZX+I/R組潛伏期明顯縮短為48.6±5.71s，DZX+5-HD+ I/R組顯著延

16、長(zhǎng)了潛伏期時(shí)間為89.3±9.83s。第2和第3天各組的潛伏期均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而I/R模型組的潛伏期時(shí)間顯著高于假手術(shù)組和DZX+I/R組。
　　3.各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較：水迷宮實(shí)驗(yàn)開始后的第4天平臺(tái)撤除后，觀察各組大鼠的記憶能力。結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠停留平臺(tái)象限時(shí)間達(dá)到33.12±3.34s，I/R模型組的時(shí)間為18.56±3.56s，DZX+I/R組為24.23±4.45s，DZX+5-HD+ I/R組為16.45±

17、5.67s，各組穿越原平臺(tái)次數(shù)分別為4.1±1.2次，1.2±0.2次，2.8±0.3次和1.8±0.5次。模型組大鼠在原平臺(tái)象限的停留時(shí)間與假手術(shù)組相比明顯減少，穿越原平臺(tái)象限的次數(shù)也明顯減少，二治療組大鼠在原平臺(tái)象限的停留時(shí)間時(shí)間較模型組大鼠可見顯著延長(zhǎng)，同時(shí)其穿越原平臺(tái)的次數(shù)也有顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；各組大鼠的游泳速度相比較之間無(wú)顯著差異。
　　4.神經(jīng)功能缺損評(píng)分統(tǒng)計(jì)分析：與假手術(shù)組比，模型組大鼠神經(jīng)

18、功能缺損得分明顯升高（5.86±0.63），說(shuō)明已經(jīng)成功造模，造模后神經(jīng)損傷嚴(yán)重。與模型組比，DZX+I/R組神經(jīng)功能缺損得分顯著降低(2.63±0.31)，DZX+5-HD+ I/R組神經(jīng)功能缺損得分再次顯著升高(5.12±0.51)。
　　5.大鼠腦梗死面積：相對(duì)于模型組， DZX+I/R組腦梗死面積顯著減少，DZX+5-HD+ I/R組的腦梗死面積也減少。
　　6.大鼠腦梗死面積的組織學(xué)分析：假手術(shù)組中腦組織比較完整，

19、無(wú)明顯異常。但與假手術(shù)組相比，在I/R組中可見明顯的壞死腦組織。DZX+I/R組腦部未見明顯的壞死組織。DZX+5-HD+ I/R組腦部有明顯的壞死組織，但是壞死組織比單純的模型組少。
　　7. TUNEL法檢測(cè)大鼠腦組織細(xì)胞凋亡：TUNEL法染色后20倍物鏡下觀察，凋亡細(xì)胞胞核深染，呈棕黃色至褐色。假手術(shù)組只有較少的細(xì)胞凋亡，假手術(shù)組的凋亡指數(shù)為（0.33±0.05）。與假手術(shù)組相比，模型組中有較多的凋亡細(xì)胞，模型組中的凋亡指數(shù)

20、為（2.33±0.82）。DZX+I/R組中凋亡的細(xì)胞顯著減少，其凋亡指數(shù)為（1.33±0.72）。DZX+5-HD+ I/R組凋亡數(shù)目明顯增加，其凋亡指數(shù)為（1.53±0.52）。
　　第四部分：
　　1.腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元進(jìn)行大鼠lncRNAs基因芯片檢測(cè)：在假手術(shù)組和I/R組的腦組織進(jìn)行l(wèi)ncRNA基因芯片分析，通過(guò)p值和FDR值的閾值確定，有12條lncRNAs在I/R組明顯上調(diào)。各組應(yīng)用RT-PCR驗(yàn)證差異

21、基因，在腦組織中檢測(cè)這12條lncRNAs的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)lncRNA S66184的表達(dá)與DZX密切相關(guān)。
　　2.大鼠海馬神經(jīng)元中驗(yàn)證lncRNA S66184的表達(dá)：DZX+I/R組與I/R組對(duì)比發(fā)現(xiàn)lncRNA S66184明顯下調(diào)。
　　3.大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的糖氧剝奪細(xì)胞模型中驗(yàn)證lncRNA S66184的表達(dá)：與正常對(duì)照組相比，在大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞糖氧剝奪模型里， lncRNA S66184明顯上調(diào)。

22、　　4.大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的糖氧剝奪細(xì)胞模型與凋亡相關(guān)基因之間的關(guān)系： RT-PCR的方法來(lái)檢測(cè)糖氧剝奪與凋亡相關(guān)基因的關(guān)系。與正常組相比，氧糖剝奪組凋亡相關(guān)基因caspase3、caspase7、caspase8、caspase9、caspase12、Bax明顯上調(diào)。
　　5.大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的糖氧剝奪細(xì)胞模型中 DZX與凋亡基因之間的關(guān)系：對(duì)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行不同處理分為：NC組，OGD組，DZX+OGD組，DZX+5-

23、HD+OGD組，RT-PCR檢測(cè)相關(guān)凋亡基因。與OGD組相比DZX+OGD組的凋亡相關(guān)基因被下調(diào)，與DZX+OGD組相比DZX+5-HD+OGD組凋亡相關(guān)基因被上調(diào)，但未超過(guò)OGD組凋亡相關(guān)基因表達(dá)。
　　6.在大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的糖氧剝奪細(xì)胞模型中DZX與lncRNA S66184對(duì)凋亡基因之間的關(guān)系：前面得到的lncRNA S66184，在大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的糖氧剝奪細(xì)胞模型里加入DZX后過(guò)表達(dá)其表達(dá)，DZX對(duì)caspase3

24、,caspae12,Bax下調(diào)作用被逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論:
　　第一部分：
　　1.通過(guò)生物信息學(xué)GSE生物芯片分析證實(shí)ATP敏感性鉀離子通道參與了氧糖剝奪神經(jīng)元損傷病理過(guò)程。其中有7個(gè)差異基因同時(shí)存在皮質(zhì)和紋狀體中。
　　2.通過(guò)電生理膜片鉗檢測(cè)發(fā)現(xiàn)KATP開放劑二氮嗪（DZX）可部分抑制ERS通路從而對(duì)OGD引起的神經(jīng)元損傷仍有保護(hù)作用。
　　第二部分：
　　1.通過(guò)采用原代細(xì)胞分離技術(shù)成功構(gòu)建大鼠海

25、馬神經(jīng)元OGD。
　　2.通過(guò)流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)說(shuō)明ATP敏感鉀通道開放劑DZX對(duì)氧糖剝奪引起的海馬神經(jīng)元損傷有到保護(hù)作用。
　　3.通過(guò)分別對(duì)氧糖剝奪引起的海馬神經(jīng)元細(xì)胞和海馬腦膜片進(jìn)行研究，觀察到ATP敏感鉀通道開放劑DZX能抵抗由ERS引起的海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。
　　4.ATP敏感鉀通道開放劑DZX通過(guò)對(duì)凋亡相關(guān)基因的調(diào)控實(shí)現(xiàn)對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的抑制。
　　第三部分：
　　1.通過(guò)采用線栓塞法構(gòu)建腦

26、缺血再灌注的大鼠模型。
　　2. ATP敏感鉀通道開放劑DZX對(duì)大鼠I/R損傷有明顯的保護(hù)作用。
　　3.ATP敏感鉀通道開放劑DZX對(duì) MCAO大鼠的不同時(shí)間學(xué)習(xí)記憶能力有改善作用。
　　第四部分：
　　1.通過(guò)對(duì)動(dòng)物假手術(shù)組和I/R組的腦組織進(jìn)行l(wèi)ncRNA基因芯片實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)I/R組上調(diào)了12條lncRNAs。
　　2.通過(guò)對(duì)lncRNA芯片數(shù)據(jù)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)lncRNA S66184的表達(dá)與DZX密切相關(guān)

27、。
　　3.在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)ATP敏感鉀通道開放劑DZX與lncRNA S66184存在調(diào)控關(guān)系。
　　4. ATP敏感鉀通道開放劑DZX對(duì)某些凋亡基因的調(diào)控作用與動(dòng)物模型里的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　5.ATP敏感鉀通道開放劑DZX通過(guò)調(diào)控lncRNA S66184進(jìn)而調(diào)控caspase3,caspase12,Bax的表達(dá)，以達(dá)到對(duì)損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用。
　　全文結(jié)論:綜上所述，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),我們