高濃度氫氣對(duì)機(jī)械損傷性脊髓神經(jīng)元的保護(hù)作用研究.pdf

1、近些年，人類脊髓損傷發(fā)病率呈遞增趨勢(shì)，其嚴(yán)重致殘性不言而喻。脊髓損傷可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩大類。后者是指在脊髓受外力作用后，損傷區(qū)域產(chǎn)生復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，損害周圍正常脊髓組織，導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域變大。目前大多數(shù)脊髓損傷的研究關(guān)注于繼發(fā)性脊髓損傷。脊髓損傷涉及的病理機(jī)制較多、治療效果不理想，當(dāng)前脊髓損傷的治療主要從抗炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡等機(jī)制著手。
　　氧化應(yīng)激是繼發(fā)性脊髓損傷中神經(jīng)元壞死、凋亡，神經(jīng)功能紊亂的重要因

2、素。日本學(xué)者Ohsawa于2007年研究發(fā)現(xiàn)，氫氣可以選擇性清除羥基和過(guò)氧亞硝基陰離子，降低腦梗死面積，改善腦功能，這一發(fā)現(xiàn)引起人們對(duì)氫氣的廣泛研究。近些年，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)氫分子在抗氧化應(yīng)激損傷方面發(fā)揮作用。
　　氫氣作為一種新的抗氧化劑，具有滲透性好、來(lái)源廣泛等特點(diǎn)，因此本研究通過(guò)培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞、制作神經(jīng)元機(jī)械損傷模型，發(fā)現(xiàn)高濃度氫氣在減輕氧化應(yīng)激損傷、保護(hù)線粒體功能、抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮作用，有望為脊髓損傷

3、提供治療選擇。
　　第一部分:脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　此部分實(shí)驗(yàn)我們以出生四天的雌性小鼠為原料，采用差速貼壁法純化和培養(yǎng)原代神經(jīng)元細(xì)胞，采用脊髓神經(jīng)元特異性染色（烯醇化酶染色）對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行鑒定，免疫熒光顯微鏡下可見(jiàn)神經(jīng)元成黃綠色，布滿整個(gè)視野，神經(jīng)元突起清晰。結(jié)果提示成功分離和培養(yǎng)小鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞。
　　第二部分:不同濃度氫氣對(duì)機(jī)械損傷性神經(jīng)元的形態(tài)作用分析
　　此部分實(shí)驗(yàn)我們研究三種不同濃度（5

4、0％、65％和75％）氫氣對(duì)機(jī)械損傷性神經(jīng)元形態(tài)的影響，采用神經(jīng)元機(jī)械損傷模型，光鏡結(jié)果見(jiàn)75％氫氣組在給予氫氣治療后損傷區(qū)域脊髓神經(jīng)元細(xì)胞有少量遷移，神經(jīng)特異性烯醇化酶NSE免疫熒光染色結(jié)果見(jiàn)各組差異不明顯，微絲微管的免疫熒光染色結(jié)果見(jiàn)75％氫氣治療組的細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)均勻，細(xì)胞骨架伸展，提示濃度為75％的氫氣較濃度為50％和65％的氫氣在神經(jīng)元機(jī)械損傷模型中更有利于神經(jīng)元的遷移，維持神經(jīng)元形態(tài)。
　　第三部分:高濃度氫氣對(duì)機(jī)械

5、損傷性神經(jīng)元的保護(hù)作用分析
　　此部分實(shí)驗(yàn)我們研究濃度為75％的氫氣對(duì)機(jī)械損傷性神經(jīng)元的保護(hù)作用，采用超氧化物陰離子熒光探針檢測(cè)術(shù)后各組神經(jīng)元活性氧自由基含量;流式細(xì)胞儀和Tunel染色檢測(cè)神經(jīng)元的凋亡情況;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)MDA和8-OhdG的含量、Western blot檢測(cè)SOD1、SOD2、Nox2和Nox4的含量。結(jié)果顯示脊髓神經(jīng)元損傷后ROS、MDA、8-OhdG、Nox2和Nox4的含量增高，SOD1、SOD2含

6、量降低;高濃度氫氣治療后ROS、MDA、8-OhdG、 Nox2和Nox4的含量降低，SOD1、SOD2含量升高;流式細(xì)胞儀和Tunel染色結(jié)果顯示脊髓神經(jīng)元損傷后神經(jīng)元凋亡增多，高濃度氫氣治療后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)降低，以上結(jié)果提示濃度為75％的氫氣抑制Nox2和Nox4的表達(dá)，提高抗氧化酶SOD1、SOD2的表達(dá)，抑制ROS生成、減輕脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。
　　第四部分:高濃度氫氣對(duì)脊髓神經(jīng)元線粒體的作用研究
　　

7、此部分實(shí)驗(yàn)我們研究濃度為75％的氫氣對(duì)脊髓神經(jīng)元線粒體的影響，觀察術(shù)后各組神經(jīng)元線粒體的超微結(jié)構(gòu)、檢測(cè)線粒體膜電位變化、神經(jīng)元ATP含量、抗氧化酶、凋亡蛋白含量，結(jié)果顯示神經(jīng)元機(jī)械損傷后線粒體受損、膜電位降低、ATP含量降低，Bax和caspase3表達(dá)上調(diào)、Bcl-2表達(dá)下調(diào)、抗氧化酶PrxⅢ和Trx2含量降低，給予氫氣治療后受損線粒體有所恢復(fù)、膜電位和ATP含量提高、Bax和caspase3表達(dá)下調(diào)、Bcl-2表達(dá)上調(diào)、抗氧化酶Pr