細(xì)胞外ATP對周圍神經(jīng)損傷后脊髓神經(jīng)元作用及機(jī)制的實驗研究.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷后軸突的再生是實現(xiàn)功能恢復(fù)的前提。因此，認(rèn)清神經(jīng)元在軸突損傷后的病理變化過程具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)一系列的神經(jīng)營養(yǎng)因子(Neurotrophicfactors，NTF)、神神經(jīng)遞質(zhì)和激素等在神經(jīng)生長、發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、再生等過程中起重要作用。脊髓神經(jīng)元和雪旺細(xì)胞表面P2Y受體亞型的存在及其介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的電生理變化和細(xì)胞增殖，證明細(xì)胞外ATP可以保護(hù)受損的神經(jīng)元，這種作用是通過P2Y受體介導(dǎo)的。近來發(fā)現(xiàn)：Na+-K+-A

2、TPase不僅具有離子泵的功能，還具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的作用。細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子作為一種重要的信號分子，參與細(xì)胞內(nèi)多種生理生化反應(yīng)。肌漿網(wǎng)豐富的Ca2+-ATPase對細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡起著重要作用。本實驗主要分為以下三部分。 第一部分細(xì)胞外ATP對坐骨神經(jīng)損傷后脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元和靶肌肉ATPase活性影響的研究 目的：了解細(xì)胞外ATP對坐骨神經(jīng)損傷后腓腸肌和相應(yīng)脊髓節(jié)段ATPase活性的影響。方法：成年SD大鼠105只，

3、隨機(jī)分成三組，A組為損傷組：右側(cè)坐骨神經(jīng)損傷后靶肌肉局部注射生理鹽水組，B組為對照組：右側(cè)坐骨神經(jīng)損傷后立即修復(fù)并靶肌肉局部注射生理鹽水組；C組為實驗組：右側(cè)坐骨神經(jīng)損傷后立即修復(fù)并靶肌肉局部注射0.5mgATP組。術(shù)后分別于12h、1d、3d、7d、14d、28d、56d測定腓腸肌和L4-6水平脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元Na+-K+-ATPase及Ca2+-ATPase活性和相應(yīng)時期的肌濕重變化情況。結(jié)果：細(xì)胞外ATP與修復(fù)神經(jīng)后能顯著改善A

4、TPase的活性，這種改變與肌濕重的變化相一致，與損傷組和對照組對比有顯著差異(P＜0.05)。結(jié)論：細(xì)胞外ATP可以通過對ATPase的影響對失神經(jīng)骨骼肌和脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元具有一定的保護(hù)和促進(jìn)功能恢復(fù)作用。 第二部分坐骨神經(jīng)損傷后脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元的變化及細(xì)胞外ATP對其作用的實驗研究 目的：探討大鼠坐骨神經(jīng)損傷后，對應(yīng)神經(jīng)元的變化轉(zhuǎn)歸以及局部注射ATP后對脊髓神經(jīng)元這種變化的影響及其方式。方法：成年SD大鼠210只

5、，隨機(jī)分成三組，A組為損傷組：選擇右坐骨神經(jīng)損傷后靶肌肉局部注射生理鹽水組，B組為對照組：右側(cè)坐骨神經(jīng)損傷后立即修復(fù)并靶肌肉局部注射生理鹽水組；C組為實驗組：右側(cè)坐骨神經(jīng)損傷后立即修復(fù)并靶肌肉局部注射0.5mgATP組。術(shù)后分別于12h、1d、3d、7d、14d、28d、56d通過免疫組織化學(xué)和WesternBlot技術(shù)檢測神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及p-GSK-3β(ser9)表達(dá)變化情況，評價神經(jīng)損傷后對應(yīng)脊髓神經(jīng)元的變化及ATP對這種變化的影響作

6、用。結(jié)果：坐骨神經(jīng)損傷后對應(yīng)脊髓神經(jīng)元發(fā)生以凋亡為主的變化，細(xì)胞外ATP與修復(fù)神經(jīng)后能顯著改善凋亡的發(fā)生并能對GSK-3β的活性產(chǎn)生影響。結(jié)論：周圍神經(jīng)損傷后脊髓神經(jīng)元發(fā)生凋亡，局部注射ATP可以起到保護(hù)神經(jīng)元的作用，這種作用與GSK-3β有關(guān)。 第三部分細(xì)胞外ATP對體外培養(yǎng)的機(jī)械損傷的脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元作用機(jī)制的實驗研究 目的：研究細(xì)胞外ATP對體外培養(yǎng)的機(jī)械損傷的脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元的作用機(jī)制。方法：取新生大鼠脊髓，

7、通過常規(guī)的原代細(xì)胞培養(yǎng)程序，采用差速貼壁法分離出大鼠脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元，培養(yǎng)成熟后制作神經(jīng)元機(jī)械損傷體外模型，分為A組：對照組、B組：100μMATP組、C組：100μMATP+20μg/mlSuramin組和D組：100μMATP+10μMOuabain+10μg/mlThapsigargin組，對各組機(jī)械損傷的運(yùn)動神經(jīng)元進(jìn)行培養(yǎng)，1天后分別進(jìn)行運(yùn)動神經(jīng)元計數(shù)、MTT比色實驗觀察運(yùn)動神經(jīng)元的存活及活性、流式細(xì)胞儀分析機(jī)械損傷的脊髓前角

8、運(yùn)動神經(jīng)元凋亡百分率和WersternBlot技術(shù)檢測p-GSK-3β(ser9)的表達(dá)。結(jié)果：A組機(jī)械損傷的神經(jīng)元在培養(yǎng)1天后，運(yùn)動神經(jīng)元計數(shù)和神經(jīng)元存活及活性值最低，與D組相比沒有顯著差異，但是與B組和C組差異顯著；其凋亡細(xì)胞百分率最高，與其它三組相比有顯著差異。B組運(yùn)動神經(jīng)元計數(shù)及MTT比色實驗結(jié)果最高，與C組相比差異并不顯著，但是與A組和D組有明顯差異；其神經(jīng)元凋亡百分率最低，與其它三組相比其結(jié)果有顯著差異性；C組凋亡細(xì)胞百分率

9、與其它三組有明顯差異，但其結(jié)果優(yōu)于A組差于其它兩組；其活細(xì)胞數(shù)與B組差異不大，明顯優(yōu)于A組和D組。D組神經(jīng)元凋亡百分率明顯低于A組，與B組和C組相比沒有顯著差異，但是其存活細(xì)胞數(shù)與B組和C組存在顯著差異，與A組差異不大。 第一部分 細(xì)胞外ATP對坐骨神經(jīng)損傷后脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元和靶肌肉ATPase活性影響的研究 目的：了解細(xì)胞外ATP對坐骨神經(jīng)損傷后腓腸肌和相應(yīng)脊髓節(jié)段ATPase活性的影響。方法：成年SD大鼠1

10、05只，隨機(jī)分成三組，A組為損傷組：右側(cè)坐骨神經(jīng)損傷后靶肌肉局部注射生理鹽水組，B組為對照組：右側(cè)坐骨神經(jīng)損傷后立即修復(fù)并靶肌肉局部注射生理鹽水組；C組為實驗組：右側(cè)坐骨神經(jīng)損傷后立即修復(fù)并靶肌肉局部注射0.5mgATP組。術(shù)后分別于12h、1d、3d、7d、14d、28d、56d測定腓腸肌和L4-6水平脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元Na+-K+-ATPase及Ca2+-ATPase活性和相應(yīng)時期的肌濕重變化情況。結(jié)果細(xì)胞外ATP與修復(fù)神經(jīng)后能顯著

11、改善ATPase的活性，這種改變與肌濕重的變化相一致，與損傷組和對照組對比有顯著差異(P＜0.05)。結(jié)論：細(xì)胞外ATP可以通過對ATPase的影響對失神經(jīng)骨骼肌和脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元具有一定的保護(hù)和促進(jìn)功能恢復(fù)作用。 第二部分 坐骨神經(jīng)損傷后脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元的變化及細(xì)胞外ATP對其作用的實驗研究 目的：探討大鼠坐骨神經(jīng)損傷后，對應(yīng)神經(jīng)元的變化轉(zhuǎn)歸以及局部注射ATP后對脊髓神經(jīng)元這種變化的影響及其方式。方法：成年

12、SD大鼠210只，隨機(jī)分成三組，A組為損傷組：選擇右坐骨神經(jīng)損傷后靶肌肉局部注射生理鹽水組，B組為對照組：右側(cè)坐骨神經(jīng)損傷后立即修復(fù)并靶肌肉局部注射生理鹽水組；C組為實驗組：右側(cè)坐骨神經(jīng)損傷后立即修復(fù)并靶肌肉局部注射0.5mgATP組。術(shù)后分別于12h、1d、3d、7d、14d、28d、56d通過免疫組織化學(xué)和WesternBlot技術(shù)檢測神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及GSK-3β表達(dá)變化情況，評價神經(jīng)損傷后對應(yīng)脊髓神經(jīng)元的變化及ATP對這種變化的影響作

13、用。結(jié)果：坐骨神經(jīng)損傷后對應(yīng)脊髓神經(jīng)元發(fā)生以凋亡為主的變化，細(xì)胞外ATP與修復(fù)神經(jīng)后能顯著改善凋亡的發(fā)生并能對GSK-3β的活性產(chǎn)生影響。結(jié)論：周圍神經(jīng)損傷后脊髓神經(jīng)元發(fā)生凋亡，局部注射ATP可以起到保護(hù)神經(jīng)元的作用，這種作用與GSK-3β有關(guān)。 第三部分 細(xì)胞外ATP對體外培養(yǎng)的機(jī)械損傷的脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元作用機(jī)制的實驗研究 目的：研究細(xì)胞外ATP對體外培養(yǎng)的機(jī)械損傷的脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元的作用機(jī)制。方法：取新生

14、大鼠脊髓，通過常規(guī)的原代細(xì)胞培養(yǎng)程序，采用差速貼壁法分離出大鼠脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元，培養(yǎng)成熟后制作神經(jīng)元機(jī)械損傷體外模型，分為A組：對照組、B組：100μMATP組、C組：100μMATP+20μg/mlsuramin組和D組：100μMATP+10μMouabain+10μg/mlThapsigargin組，對各組機(jī)械損傷的運(yùn)動神經(jīng)元進(jìn)行培養(yǎng)，1天后分別進(jìn)行運(yùn)動神經(jīng)元計數(shù)、MTT比色實驗觀察運(yùn)動神經(jīng)元的存活及活性、流式細(xì)胞儀分析機(jī)械損傷

15、的脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元凋亡百分率和WesternBlot技術(shù)檢測p-GSK-3β(ser9)的表達(dá)。結(jié)果A組機(jī)械損傷的神經(jīng)元在培養(yǎng)1天后，運(yùn)動神經(jīng)元計數(shù)和神經(jīng)元存活及活性值最低，與D組相比沒有顯著差異，但是與A組和C組差異顯著；其凋亡細(xì)胞百分率最高，與其它三組相比有顯著差異。B組運(yùn)動神經(jīng)元計數(shù)及MTT比色實驗結(jié)果最高，與C組相比差異并不顯著，但是與A組和D組有明顯差異；其神經(jīng)元凋亡百分率最低，與其它三組相比其結(jié)果有顯著差異性；C組凋亡細(xì)胞

16、百分率與其它三組有明顯差異，但其結(jié)果優(yōu)于A組差于其它兩組；其活細(xì)胞數(shù)與B組差異不大，明顯優(yōu)于A組和D組。D組神經(jīng)元凋亡百分率明顯低于A組，與B組和C組相比沒有顯著差異，但是其存活細(xì)胞數(shù)與B組和C組存在顯著差異，與A組差異不大。 綜述 Na+-K+-ATP酶介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)：從蛋白質(zhì)的相互作用到細(xì)胞功能 Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)又稱為Na+泵，是P型ATPase超家族成員。除了具有轉(zhuǎn)運(yùn)離子

17、的功能之外，Na+-K+-ATPase還能影響細(xì)胞內(nèi)蛋白之間的相互作用起到傳導(dǎo)信號的作用。酶的這種作用主要是通過與蛋白和配體的特異性結(jié)合形成復(fù)合物來發(fā)揮的。在多種細(xì)胞的細(xì)胞膜上都存在Na+-K+-ATPase和與之相關(guān)的蛋白分子的結(jié)合部位，稱為內(nèi)陷小窩。在對心肌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)哇巴因與Na+-K+-ATPase結(jié)合后，可以激活胞質(zhì)內(nèi)的酪氨酸激酶，使細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化，成為不同作用的信號分子。這種有序的蛋白激酶激活級聯(lián)與促有絲分裂蛋白激