2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和血管再狹窄等血管重塑性疾病的共同細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)。很多生長(zhǎng)因子與細(xì)胞因子都會(huì)引起VSMC的增殖,其中血小板衍生因子BB(PDGF-BB)具有強(qiáng)效的促進(jìn)VSMC增殖的活性。
   Krüpple樣因子5(krüpple-like factor,IKLF/KLF5)是KLF家族中與胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的轉(zhuǎn)

2、錄調(diào)節(jié)因子。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),在血管新生內(nèi)膜的VSMC中,KLF5的表達(dá)明顯增加,后者參與反式激活PDGF-A基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。作為轉(zhuǎn)錄因子,KLF5能夠和許多轉(zhuǎn)錄因子、輔轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用,如RARα、c-jun、CBP,PPAR-δ、HDAC2、p300等相互作用,共同調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。
   hhLIM是LIM家族的成員之一,具有典型的LIM結(jié)構(gòu)域。LIM結(jié)構(gòu)域含兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),提供蛋白結(jié)合界面從而調(diào)節(jié)蛋白與蛋白的相互作用

3、。目前的研究發(fā)現(xiàn),hhLIM作為輔激活因子,可以通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用的方式調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。然而,KLF5與hhLIM是否相互作用以及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的具體分子機(jī)制尚不明確。
   為了闡明KLF5和hhLIM在PDGF-BB調(diào)節(jié)VSMC增殖中的作用,本文在系統(tǒng)觀察PDGF-BB對(duì)VSMC增殖活性影響的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討了KLF5和hhLIM在介導(dǎo)PDGF-BB促增殖中的作用和分子機(jī)制。旨在為揭示動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和血管再狹窄等

4、心血管疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù),為心血管疾病的防治提供特異性藥物靶點(diǎn)。
   方法:流式細(xì)胞光度術(shù)分析細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況:Western blot分析檢測(cè)KLF5、hhLIM和Cyclin E達(dá)變化;免疫共沉淀檢查KLF5與hhLIM之間的相互作用;報(bào)告基因分析檢測(cè)KLF5和hhLIM對(duì)CyclinE因表達(dá)的影響;免疫組織化學(xué)觀察整體水平KLF5、hhLIM和Cyclin E達(dá)變化。
   結(jié)果:

5、>   1 PDGF-BB促進(jìn)VSMC細(xì)胞周期的進(jìn)程
   流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,0 ng、5 ng、10 ng、20 ng的PDGF-BB于作用VSMC后,G1期細(xì)胞數(shù)量減少,S期細(xì)胞數(shù)量增加,表明VSMC在PDGF-BB作用下增殖活性明顯升高。細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果也顯示,PDGF-BB可以顯著促進(jìn)VSMC的增殖。上述結(jié)果提示,PDGF-BB可加快VSMC細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)VSMC增殖。
   2 PDGF

6、-BB促進(jìn)hhLIM的表達(dá)
   用不同濃度的PDGF-BB刺激細(xì)胞24 h后,提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot分析。Western blot結(jié)果顯示,hhLIM的表達(dá)量呈劑量依賴性的增加,而KLF5的表達(dá)量沒有明顯的變化。提示,PDGF-BB能誘導(dǎo)hhLIM表達(dá),不影響KLF5表達(dá)。
   3 PDGF-BB促進(jìn)KLF5與hhLIM的相互作用
   提取被PDGF-BB刺激前后的VSMC總蛋白,進(jìn)行免

7、疫共沉淀。結(jié)果顯示,在PDGF-BB刺激前后的VSMC中,KLF5和hhLIM均可被共沉淀,提示KLF5與hhLIM之間存在相互作用。PDGF-BB刺激后,免疫沉淀物中的KLF5和hhLIM均明顯增多,說(shuō)明PDGF-BB促進(jìn)二者之間的相互作用。
   4 KLF5與hhLIM協(xié)同促進(jìn)球囊損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生
   為探討KLF5和hhLIM在血管重塑中所發(fā)揮的作用,我們用腺病毒轉(zhuǎn)染的方法使球囊損傷的大鼠頸總動(dòng)脈過(guò)表達(dá)K

8、LF5和hhLIM。HE染色結(jié)果,球囊損傷14天后,模型組和hhLIM過(guò)表達(dá)組內(nèi)膜呈彌散性增厚,管腔縮小,內(nèi)膜/中膜(I/M)比值分別為(3.33±0.26)和(3±0.26),兩組之間無(wú)明顯差異。而KLF5組(I/M比值4.12±0.23)與共轉(zhuǎn)染KLF5與hhLIM組(I/M比值6.40±0.23)顯著大于模型組和hhLIM過(guò)表達(dá)組(P<0.05),提示hhLIM與KLF5協(xié)同作用促進(jìn)VSMC增殖。免疫組化結(jié)果顯示,正常血管內(nèi)膜僅有

9、少量PCNA表達(dá)。球囊損傷14天時(shí),PCNA陽(yáng)性染色的細(xì)胞及單細(xì)胞染色強(qiáng)度均較正常組顯著增高。KLF5組(56±3.6%)尤其是共轉(zhuǎn)染KLF5和hhLIM組(70±2.3%)PCNA陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量顯著高于model組(26±3.7%)和hhLIM組(33±1.7%)。上述結(jié)果提示,hhLIM協(xié)同KLF5促進(jìn)球囊損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生。
   5 KLF5和hhLIM協(xié)同促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的進(jìn)程
   細(xì)胞

10、計(jì)數(shù)分析結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)KLF5血管平滑肌的細(xì)胞數(shù)明顯高于過(guò)表達(dá)hhLIM和pAd組,說(shuō)明KLF5可以促進(jìn)VSMC增殖。同時(shí)過(guò)表達(dá)KLF5和hhLIM細(xì)胞數(shù)(17±3×104)顯著多于KLF5過(guò)表達(dá)組(14±2×104),說(shuō)明hhLIM加速了KLF5促進(jìn)細(xì)胞的增殖的能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布結(jié)果顯示,與KLF5過(guò)表達(dá)組相比,KLF5和hhLIM聯(lián)合過(guò)表達(dá)組于作用VSMC24 h后,G1期細(xì)胞數(shù)量減少,S期細(xì)胞數(shù)量增加,表明VSMC

11、在KLF5和hhLIM聯(lián)合作用下增殖活性明顯升高。進(jìn)一步在細(xì)胞水平上證明hhLIM與KLF5協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程。
   6 KLF5和hhLIM協(xié)同促進(jìn)Cyclin E的表達(dá)
   為進(jìn)一步探討KLF5和hhLIM促進(jìn)細(xì)胞增殖的分子機(jī)制,我們檢測(cè)了一系列細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,Western blot結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)KLF5后CDK2,CyclinD,CyclinE的表達(dá)水平都顯著升高,hhLIM過(guò)表達(dá)對(duì)上述

12、基因表達(dá)影響不大,但是,同時(shí)過(guò)表達(dá)KLF5和hhLIM可以顯著激活CyclinE的表達(dá)。上述結(jié)果表明,KLF5和hhLIM可能是通過(guò)協(xié)同促進(jìn)CyclinE的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。與模型組和KLF5過(guò)表達(dá)組相比,同時(shí)過(guò)表達(dá)KLF5和hhLIM組的動(dòng)物模型血管組織中,CyclinE的表達(dá)顯著增加。以上結(jié)果分別從細(xì)胞水平及整體水平證實(shí),hhLIM可以與KLF5協(xié)同作用促進(jìn)Cyclin E表達(dá)。
   7 hhLIM通過(guò)KLF5協(xié)同激活

13、CyclinE啟動(dòng)子
   為探討KLF5與hhLIM協(xié)同促進(jìn)CyclinE表達(dá)的分子機(jī)制,分別將CyclinE啟動(dòng)子指導(dǎo)的報(bào)告基因質(zhì)粒(Cyclin E-luc)與KLF5和/或hhLIM表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)定量分析啟動(dòng)子的活性。結(jié)果顯示,CHO細(xì)胞共轉(zhuǎn)染KLF5和hhLIM后,啟動(dòng)子所激活的熒光素酶活性與KLF5轉(zhuǎn)染組相比顯著升高。提示,KLF5和hhLIM協(xié)同激活CyclinE基因的啟動(dòng)

14、子。CylinE啟動(dòng)子上有兩個(gè)特異的KLF5的結(jié)合位點(diǎn)(TCE),為進(jìn)一步探明二者相互作用的分子機(jī)制,我們特異性敲低KLF5和/或hhLIM并給予PDGF-BB刺激,Oligo pull-down結(jié)果顯示,特異性敲低KLF5,KLF5與TCE元件的結(jié)合明顯下降;特異性的敲除hhLIM后,KLF5和CyclinE啟動(dòng)子區(qū)兩個(gè)TCE的結(jié)合都顯著降低,尤其是第一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(TCE1)。上述結(jié)果表明:hhLIM可能是通過(guò)促進(jìn)KLF5與Cycli

15、nE啟動(dòng)子區(qū)的第一個(gè)TCE元件而協(xié)同激活CyclinE啟動(dòng)子。
   8 hhLIM通過(guò)KLF5協(xié)同激活CyclinE表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖
   Western Blot結(jié)果顯示,不管有無(wú)PDGF-BB刺激,特異性敲低KLF5后CyclinE的表達(dá)水平顯著降低。而特異性敲低hhLIM后CyclinE的表達(dá)變化不明顯。說(shuō)明,hhLIM促進(jìn)Cyclin E的作用是通過(guò)KLF5來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
   整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明,與模型組

16、(3.33±0.26)相比,特異性敲低KLF5組(0.5±0.5)的大鼠血管內(nèi)膜/中膜比值明顯降低,PCNA陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)也明顯降低(P<0.05)。特異性敲低hhLIM組(5.0±1.7)與模型組相比,無(wú)明顯的抑制增殖作用,反而有輕微促增殖作用。Western blot結(jié)果進(jìn)一步表明,特異性敲低KLF5的大鼠血管CyclinE的表達(dá)水平較其他組明顯降低。上述結(jié)果在整體水平及細(xì)胞水平證實(shí),hhLIM通過(guò)KLF5協(xié)同激活CyclinE表達(dá)

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