bFGF和PDGF-BB作用內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)血管形成及相關(guān)信號(hào)分子的研究.pdf

1、前言:內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，即能循環(huán)、增殖并分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞。自從1997年Asahara等首次從成人外周血中分離出EPCs，并證實(shí)EPCs在生后的生理性和病理性血管新生中發(fā)揮重要作用以來。EPCs介導(dǎo)的缺血組織血管再生(即治療性血管新生)的研究已取得了較大的進(jìn)展。
　　 正常情況下，骨髓中EPCs處于休眠狀態(tài)，細(xì)胞因子可以促進(jìn)EPCs動(dòng)員

2、、遷移和分化并參與新血管形成。EPCS的多向分化潛能是其最重要的生物學(xué)特征，EPCs具體向哪個(gè)方向分化及其調(diào)控機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。以往認(rèn)為，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞來源于不同的前體細(xì)胞，但最近Yamashita和Lino等人的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞可以來自同一前體細(xì)胞。而且有人在體內(nèi)外的血管形成研究中發(fā)現(xiàn)，成熟的內(nèi)皮細(xì)胞可以轉(zhuǎn)分化為血管平滑肌細(xì)胞。因此，這些均可為研究EPCs的平滑肌分化潛能奠定一定的理論基礎(chǔ)。
　　 EP

3、Cs的分化受多種因素的影響，如缺氧、生長因子等，然后通過復(fù)雜的信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種基因的表達(dá)，最終引起EPCs的不同方向分化。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)主要通過對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的直接絲裂原作用促進(jìn)新生血管的形成。PDGF-BB是目前研究其在血管形成和穩(wěn)定方面比較熱點(diǎn)的一種生長因子，Betsholtz將PDGF-B和PDGFR-β基因敲出后發(fā)現(xiàn)：新形成的血管缺乏周細(xì)胞/平滑肌細(xì)胞募集，這也說明PDGF-BB

4、是血管成熟的重要因子。
　　 目前人們就治療性血管新生進(jìn)行了廣泛的研究，但是許多研究還只是注重新生血管形成的多少而忽略了新形成血管的成熟性和穩(wěn)定性。一個(gè)成熟、功能血管網(wǎng)的形成需要內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的相互作用，因?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞只能啟動(dòng)血管形成過程，但不能完善新形成的血管，如果要想使新生血管成熟，則必須要有平滑肌/周細(xì)胞的參與。因此，如果能分離出既能分化為內(nèi)皮細(xì)胞又能分化為平滑肌細(xì)胞潛能的干/祖細(xì)胞，同時(shí)這種干/祖細(xì)胞源性的內(nèi)皮細(xì)胞和

5、平滑肌細(xì)胞又具有明顯的增殖、遷移能力，這將為功能血管網(wǎng)的形成奠定雄厚的基礎(chǔ)。
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞并參與在治療性血管生成中，這一現(xiàn)象早已被許多實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。通常生長因子與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，可以激活其下游分子而發(fā)揮促細(xì)胞分化、增殖等作用。磷脂酶C-γ(PLC-γ)是生長因子信號(hào)通路的一個(gè)重要信號(hào)中介，可被生長因子酪氨酸受體所激活，細(xì)胞外生長因子調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化主要通過其受體的酪氨酸激酶被活化而發(fā)揮作用的。通常人們

6、認(rèn)為PLC-γ是一個(gè)與細(xì)胞增殖和分化有重要關(guān)系的分子。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是細(xì)胞發(fā)揮功能的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。真核細(xì)胞中，已確定出ERK(p42/p44MAPK)，JNK/SAPK，p38MAPK及ERK5四條MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其中JNK和p38MAPK兩條通路主要與細(xì)胞的應(yīng)激和凋亡有關(guān)，而在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中處于樞紐地位的ERK通路主要與細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)。
　　 基于EPCs的多向分化潛能以及bFGF和

7、PDGF-BB在體內(nèi)穩(wěn)定新形成血管的作用，本研究假設(shè)在bFGF和PDGF-BB分別誘導(dǎo)下，大鼠骨髓EPCs能向血管內(nèi)皮樣細(xì)胞和平滑肌樣細(xì)胞分化并參與成熟功能血管網(wǎng)的形成；同時(shí)通過檢測這二種細(xì)胞的增殖、遷移和形成血管的能力明確其能否成為新血管形成的種子細(xì)胞。此外，探究bFGF和PDGF-BB介導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化、增殖的相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)，為闡明內(nèi)皮祖細(xì)胞的多向分化機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1、大鼠內(nèi)皮祖細(xì)

8、胞分離、培養(yǎng)及鑒定采用Ficoll密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁篩選法從大鼠骨髓分離EPCs；收集培養(yǎng)5d的EPCs，經(jīng)免疫熒光染色，AC133和vWF雙染陽性細(xì)胞為正在分化的EPCs。
　　 2、EPCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)及形態(tài)觀察EPCs被培養(yǎng)5天后，進(jìn)行分組，對(duì)照組僅給20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；bFGF組在20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中添加bFGF(30ng/ml)；PDGF-BB組在20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中添加PDG

9、F-BB(40ng/ml)。共培養(yǎng)14天，培養(yǎng)期間每2-3天換液并補(bǔ)充相應(yīng)生長因子。每天觀察細(xì)胞形態(tài)變化并采集圖像。
　　 3、免疫熒光檢測EPCs分化標(biāo)記物EPCs在置有玻片的24孔板內(nèi)被誘導(dǎo)到第4天和第8天時(shí)，換無血清培養(yǎng)基孵育24h后，取出玻片，經(jīng)4％多聚甲醛固定，5％BSA.封閉后加入一抗，4℃過夜，加入FITC、PE和TRITC分別標(biāo)記的相應(yīng)二抗，37℃孵育，封片，熒光顯微鏡觀察、采集圖像并進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。
　

10、　 4、Westerll Blotting檢測EPCs分化相關(guān)蛋白表達(dá)取EPCs被誘導(dǎo)到第4天和第8天時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行檢測：各組細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)提取后，-70℃保存?zhèn)溆?。配制濃縮膠及分離膠，上樣后電泳2.5h，PVDF轉(zhuǎn)膜1-2.5h，5％脫脂奶粉封閉1.5h，加一抗(1:200)，4℃過夜，二抗(1:1000)室溫孵育1h，DAB染色，測定灰度值。
　　 5、透射電子顯微鏡檢測分化后EPCs的超微結(jié)構(gòu)被誘導(dǎo)至14天的各組細(xì)胞經(jīng)消化

11、，離心(1000rmp，10min)，收集細(xì)胞后用2.5％戊二醛在4℃固定60 min，漂洗后再用1％OSO4固定90min，置梯度丙酮中逐級(jí)脫水、媒浸、包埋、聚合、切片，用醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重電子染色，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 6、流式細(xì)胞儀分析分化細(xì)胞百分率用0.125％胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，終止消化，將細(xì)胞懸液離心(1000rpm.5min)，棄上清；用0.5％BSA-PBS漂洗再離心，收集入1.5ml

12、 EP管；向bFGF組細(xì)胞內(nèi)加入vWF抗體，向PDGF-BB組細(xì)胞內(nèi)加入α-SMA抗體，對(duì)照組內(nèi)同時(shí)加入vWF和α-SMA抗體，37℃，40min；0.5％BSA-PBS漂洗，再向各組加入相應(yīng)FTTC標(biāo)記及PE標(biāo)記二抗，37℃，20min，并設(shè)同型對(duì)照；重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。
　　 7、內(nèi)皮樣和平滑肌樣細(xì)胞活力檢測
　　 (1)MTT法檢測被誘導(dǎo)細(xì)胞增殖活性消化收集各組細(xì)胞；以5×103/孔的細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，

13、每孔體積200μl；放入37℃、5％CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)2h；待細(xì)胞基本融合，加入3％血清DMEM作用24h；分組：①時(shí)間依賴組：內(nèi)皮樣細(xì)胞中加入bFGF(10ng/ml)、平滑肌樣細(xì)胞中加入PDGF-BB(15ng/ml)并設(shè)立相應(yīng)對(duì)照組，分別作用0h、6h、12h、24h，48h；②濃度依賴組：內(nèi)皮樣細(xì)胞中按0、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml和16ng/ml濃度梯度加入bFGF；平滑肌樣細(xì)胞中按0、3ng/ml、6ng/m

14、l、9ng/ml和18ng/ml加入PDGF-BB，作用24小時(shí)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)5個(gè)平行孔；檢測時(shí)，每孔加入20μlMTT(5mg/ml)孵育4h，吸除孔內(nèi)液體，每孔加入150μlDMSO，微量振蕩器震蕩10min，置酶標(biāo)儀測定OD490值。
　　 (2)內(nèi)皮樣和平滑肌樣細(xì)胞遷移的檢測消化各組細(xì)胞，用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液；以5×104/小室的細(xì)胞數(shù)加入Transwell小室的上室，體積200μl，將600μ

15、l無血清DMEM加入Transwell小室的下室，并按(1)中的分組加入bFGF和PDGF-BB；每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。檢測時(shí)，吸除上室培養(yǎng)液，PBS沖洗，用棉簽擦拭膜上表面未遷移的細(xì)胞；甲醇固定膜，吉姆薩染色；將膜切下，用中性樹膠封固于載玻片上；光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)。
　　 (3)內(nèi)皮樣和平滑肌樣細(xì)胞形成管腔的檢測將Matrigel膠置于4℃冰箱過夜，使之凍融；預(yù)冷的24孔板加入Matrigel150μL/孔

16、，37℃孵育1h備用；消化各組細(xì)胞，用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液；以5～6×105/ml的細(xì)胞數(shù)接種細(xì)胞于涂有Matrigel的24孔板內(nèi)，培養(yǎng)24-48h。共分四組：①只接種內(nèi)皮樣細(xì)胞；②只接種平滑肌樣細(xì)胞：③在內(nèi)皮樣(未標(biāo)記的)形成的管腔中加入平滑肌樣細(xì)胞(未標(biāo)記的)共同接種；④將預(yù)先用PKH26標(biāo)記(紅色)的內(nèi)皮樣細(xì)胞和PKH67標(biāo)記的平滑肌樣細(xì)胞(綠色)以3:1的比例(4.5×105/ml：1.5×105/ml

17、)混合接種。在100倍倒置熒光相差顯微鏡下觀察并采集圖像。
　　 8、Real-time PCR檢測bFGF和PDGF-BB作用EPCs后PDGFRβmRNA表達(dá)將培養(yǎng)5天的EPCs，靜止12h，再分別用bFGF和PDGF-BB作用30min、60min、90min和180min，進(jìn)行RNA抽提并測定OD260/OD280，反轉(zhuǎn)錄后按下列條件在熒光定量PCR儀上擴(kuò)增：95℃，90sec，1個(gè)循環(huán)；95℃，5sec、58℃，30s

18、ec和72℃，4min，45個(gè)循環(huán)。最后計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
　　 9、Western Blot檢測EPCs分化相關(guān)的PLC-γ和p-ERK的表達(dá)將培養(yǎng)5天的EPCs，靜止12小時(shí)，再分別用bFGF和PDGF-BB作用30min、60min和90min，檢測PLC-γ和p-ERK的表達(dá)。細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取、濃度測定、電泳及轉(zhuǎn)印如上文十、ELISA檢測bFGF和PDGF-BB作用EPCs后VEGF的分泌將培

19、養(yǎng)5天的EPCs，靜止12小時(shí)，再分別用bFGF(10ng/ml)和PDGF-BB(15ng/ml)作用4h、8h和12h后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清并離心去沉淀(30分鐘，2500轉(zhuǎn)/分鐘)，收集上清保存于-20℃。按試劑盒說明書按步驟進(jìn)行，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程計(jì)算出樣品濃度。
　　 結(jié)果:
　　 1、內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定原代培養(yǎng)24h后，細(xì)胞大部分呈小圓形；差速貼壁篩選后，培養(yǎng)一天可見少量細(xì)胞貼壁；第2天即可觀察到多

20、且大小相對(duì)均一的圓形貼壁細(xì)胞，陸續(xù)可見從細(xì)胞一側(cè)伸出芽狀突起并逐漸伸展成梭形或紡錘形，第5天時(shí)呈“鋪路石”樣排列。在第5天采用免疫熒光進(jìn)行CD133+vWF雙標(biāo)染色，細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD133和vWF，即被培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)特異性干細(xì)胞抗原和內(nèi)皮細(xì)胞抗原，表明其為EPCs。
　　 2、EPCs經(jīng)bFGF和PBGF-BB誘導(dǎo)后其形態(tài)學(xué)變化在EPCs被誘導(dǎo)4天后，對(duì)照組細(xì)胞顯示長的芽狀突起；FICs呈現(xiàn)鋪路石的表面；PICs形成梭形外觀，且

21、有呈束狀排列的趨勢。在8天后，NICs形成多個(gè)突起，而FICs顯示短梭形；PICs形成“峰與谷”的排列。
　　 3、免疫熒光檢測EPCs在bFGF和PBGF-BB誘導(dǎo)下標(biāo)記物的變化與NICs相比，F(xiàn)ICs在第4天和第8天都有明顯的內(nèi)皮標(biāo)記物(PECAM-1，vWF)熒光染色，而且第8天與第4天比，F(xiàn)ICs的熒光強(qiáng)度更加明顯；PICs在第4天和第8天都顯示明顯的平滑肌細(xì)胞(α-SMA，calponin)熒光染色，尤其在第8天，PI

22、Cs顯示了較強(qiáng)的平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)；NICs對(duì)平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物(除PECAM-1外)表達(dá)一直是陰性的。
　　 4、bFGF和PBGF-BB作用EPCs后，其分化相關(guān)蛋白的表達(dá)當(dāng)細(xì)胞被誘導(dǎo)到第4天時(shí)，仍然有CD133的表達(dá)，但到第8天時(shí)，CD133的表達(dá)消失，這說明被誘導(dǎo)的細(xì)胞已經(jīng)失去干/祖細(xì)胞的標(biāo)記。對(duì)FICs而言，誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后都有PECAM-1的表達(dá)，但誘導(dǎo)后尤其是達(dá)到8天時(shí)，PECAM-1表達(dá)明顯增強(qiáng)。

23、同樣對(duì)PICs來說，也逐漸顯示出平滑肌細(xì)胞靶向蛋白α-SMA和calponin的表達(dá)，即與誘導(dǎo)前比，誘導(dǎo)至第4天時(shí)就有α-SMA和calponin的表達(dá)；誘導(dǎo)至第8天時(shí)，α-SMA和calponin的表達(dá)更加明顯。
　　 5、EPCs分化后超微結(jié)構(gòu)變化與誘導(dǎo)前EPCs相比，F(xiàn)ICs和PICs內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)，尤其是線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體。但在FICs和PICs內(nèi)并未見到Weibel-Palade小體和肌絲及密體結(jié)構(gòu)。

24、>　　 6、bFGF和PDGF-BB分別誘導(dǎo)EPCs后，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物陽性的細(xì)胞百分率EPCs經(jīng)bFGF作用后，具有內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記vWF的細(xì)胞可達(dá)72.83％；而EPCs經(jīng)PDGF-BB作用后，具有平滑肌細(xì)胞標(biāo)記α-SMA的細(xì)胞可達(dá)68.36％，但在對(duì)照組中具有上述兩種標(biāo)記的細(xì)胞僅僅2％。
　　 7、bFGF和PDGF-BB分別對(duì)內(nèi)皮樣細(xì)胞和平滑肌樣細(xì)胞影響
　　 (1)內(nèi)皮樣細(xì)胞和平滑肌樣細(xì)胞增殖的能力相同

25、濃度下，在0-48h期間，bFGF促進(jìn)內(nèi)皮樣細(xì)胞和PDGF-BB促進(jìn)平滑肌樣細(xì)胞增殖的作用隨時(shí)間延長而明顯增強(qiáng)，并具有時(shí)間依賴性，同時(shí)也看到：bFGF和PDGF-BB在小劑量(相對(duì)于促進(jìn)EPCs分化時(shí)的劑量而言)時(shí)就能促進(jìn)上述2種細(xì)胞的增殖并且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性，但bFGF在16ng/ml、PDGF-BB在18ng/ml時(shí)增殖達(dá)高峰。
　　 (2)內(nèi)皮樣細(xì)胞和平滑肌樣細(xì)胞遷移的能力相同濃度下，在0-48h期間，bFGF促進(jìn)

26、內(nèi)皮樣細(xì)胞和PDGF-BB促進(jìn)平滑肌樣細(xì)胞遷移的作用隨時(shí)間延長而顯著增加，并具有時(shí)間依賴性；同時(shí)也看到：在小劑量bFGF(2ng/ml)和PDGF-BB(3ng/ml)(相對(duì)于促進(jìn)EPCs分化時(shí)的劑量而言)時(shí)就能促進(jìn)上述2種細(xì)胞的遷移，并且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性(三)內(nèi)皮樣細(xì)胞和平滑肌樣細(xì)胞參與管腔形成的能力結(jié)果顯示：內(nèi)皮樣細(xì)胞伸長并形成管腔，而平滑肌樣細(xì)胞則呈彌漫排列，但將上述2種細(xì)胞混合接種后，則呈現(xiàn)明顯的管腔形成。為了充分證明參

27、與形成管腔的細(xì)胞及管腔的結(jié)構(gòu)，將已標(biāo)記的內(nèi)皮樣細(xì)胞和標(biāo)記的平滑肌樣細(xì)胞共同接種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：平滑肌樣細(xì)胞與內(nèi)皮樣細(xì)胞形成了共同的血管網(wǎng)。
　　 8、bFGF和PDGF-BB作用EPCs后PDGFRβmRNA表達(dá)bFGF和PDGF-BB作用EPCs后都會(huì)有PDGFRβmRNA的表達(dá)。bFGF作用組：PDGFRβmRNA在各時(shí)間點(diǎn)均有表達(dá)且與對(duì)照組比均有顯著差異，當(dāng)bFGF作用60min時(shí)表達(dá)量開始明顯增加，且在180min時(shí)最顯著。

28、PDGF-BB作用組：PDGFRβmRNA在各時(shí)間點(diǎn)也均有表達(dá)，與對(duì)照組比較，PDGFRβmRNA表達(dá)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相鄰時(shí)間點(diǎn)的進(jìn)行比較差異均也比較顯著。
　　 9、EPCs分化相關(guān)的PLC-γ和p-ERK表達(dá)Western blot法檢測bFGF和PDGF-BB分別作用EPCs30min、60min和90min后PLC-γ和p-ERK的表達(dá)。結(jié)果顯示，bFGF和PDGF-BB作用EPCs后均有PLC-γ、p-ERK的表

29、達(dá)。bFGF作用組和PDGF-BB作用組：PLC-γ、p-ERK表達(dá)與對(duì)照組比均有顯著差異，且在一定范圍內(nèi)隨時(shí)間增加而逐漸增多。
　　 10、bFGF和PDGF-BB作用EPCs后VEGF的表達(dá)ELISA檢測結(jié)果顯示：EPCs在bFGF作用下可以產(chǎn)生VEGF，且在一定范圍內(nèi)隨時(shí)間的增加而增多，在PDGF-BB組VEGF也在一定范圍內(nèi)出現(xiàn)時(shí)間依賴性增加，但是較bFGF誘導(dǎo)組增加的少。
　　 結(jié)論:
　　 1、bFG

30、F可以誘導(dǎo)大鼠EPCs向內(nèi)皮方向分化。
　　 2、PDGF-BB可以誘導(dǎo)大鼠EPCs向平滑肌方向分化。
　　 3、內(nèi)皮樣細(xì)胞和平滑肌樣細(xì)胞可以增殖、遷移和形成共同的血管網(wǎng)。
　　 4、bFGF可以促進(jìn)大鼠EPCs的PDGFRβmRNA轉(zhuǎn)錄。
　　 5、bFGF和PDGF-BB可能通過啟動(dòng)大鼠EPCs中PLC-r和p-ERK途徑而發(fā)揮作用。
　　 6、bFGF促進(jìn)大鼠EPCs分化為成熟內(nèi)皮的作用可能