血管NO神經(jīng)對頸總動(dòng)脈血管平滑肌增殖的影響.pdf

1、研究目的：
　　探討血管一氧化氮（nitric oxide，NO）神經(jīng)對血管平滑肌增殖的影響及調(diào)控作用，為防治增生性血管疾病提供理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)分組與熒光金(Fluoro-gold,FG)逆行追蹤
　　將實(shí)驗(yàn)分為5組：（1）模型存活1d組;(2)模型存活5d組;(3)一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)抑制劑N’-硝基-L精氨酸（Nω-Nitro-L-argi

2、nine，LNNA）組，腹腔注射 LNNA15 mg/kg，共6天；（4）切交感神經(jīng)組；（5）假手術(shù)組。FG逆行追蹤具體方法是：將大鼠仰臥位,取頸部正中切口約3 c m，逐層分離組織至暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈鞘，用玻璃微管注射器往動(dòng)脈外膜和中膜間緩慢注射1μl30%熒光金，留針15分鐘；存活一周后用4%多聚甲醛灌注，分別取頸交感神經(jīng)節(jié)和頸總動(dòng)脈，每組3只動(dòng)物用于western bolt檢測增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating cell n

3、ucle antigen，PCNA）的表達(dá)。
　　二、FeCl3誘導(dǎo)平滑肌增殖模型
　　將大鼠仰臥位固定，沿頸部正中線切開3cm左右的切口，將右側(cè)頸總動(dòng)脈暴露，用一5cm×2cm的塑料膜片墊在頸總動(dòng)脈下方，在頸總動(dòng)脈上方置一2×1 mm含有1μL2.16 mol/L FeCl3的濾紙[1]，20 min后，取出濾紙和膜片，縫合皮膚，平滑肌增殖模型制成。
　　三、NOS免疫組織化學(xué)染色和HE染色
　　將切片用0.0

4、1 PBS洗后，用含0.04％雙氧水的甲醇封閉；正常羊血清封閉20 min；入NOS抗體（1：500）4℃過夜；生物素化二抗室溫30 min；SABC室溫30 min， DAB顯色3 min；以上各步之間用0.01M PBS沖洗3次，封片,微鏡下觀察NOS表達(dá)。取各組頸總動(dòng)脈作切片和HE染色，觀察血管平滑肌增殖變化。
　　結(jié)果：
　　FG逆行示蹤表明頸總動(dòng)脈壁主要由頸上神經(jīng)節(jié)支配，頸交感神經(jīng)節(jié)NOS免疫組織化學(xué)染色與FG示蹤

5、雙標(biāo)表明支配頸總動(dòng)脈的交感神經(jīng)中含有NO神經(jīng)，并且NO神經(jīng)支配頸總動(dòng)脈。HE染色表明，血管受損后一天平滑肌就開始增殖，5天組增殖明顯；但NOS抑制劑組（LNNA）和切除頸血管交感神經(jīng)組比5天組增殖更明顯。Western blot結(jié)果表明5天組與假手術(shù)組相比PCNA表達(dá)上調(diào)，而LNNA組和切除神經(jīng)組PCNA表達(dá)上調(diào)更明顯。
　　結(jié)論：
　　1.支配頸總動(dòng)脈的交感神經(jīng)含NO神經(jīng)。
　　2.血管交感神經(jīng)中NO神經(jīng)參與了平滑肌