心肌特異性激酶p93基因的血清水平測(cè)定及其功能初探.pdf

1、p93基因(GenBanka.c.為AF116826)是本室從成人心臟和主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)中通過(guò)大規(guī)模分離篩選新的ESTs(expressedsequencetags)克隆到的一個(gè)新基因。該基因定位在1p21-31(此區(qū)域與房室間隔缺損相關(guān))，其cDNA全長(zhǎng)約3420bp，含一個(gè)2505bp的完整閱讀框，編碼835個(gè)氨基酸，此蛋白分子量約為93kD，故命名為p93。結(jié)構(gòu)域組成分析表明p93含三種結(jié)構(gòu)域：N端為7個(gè)錨蛋白重復(fù)(ankyri

2、nrepeats，ANK)結(jié)構(gòu)域，中間為一蛋白激酶(proteinkinase，PK)結(jié)構(gòu)域，C末端為富含絲氨酸(Ser-rich)結(jié)構(gòu)域；種系發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)p93屬M(fèi)LK(mixedlineagekinase)家族成員。胎兒6種組織、成人8種組織的Northernblot結(jié)果和76種組織的多組織點(diǎn)陣膜的雜交結(jié)果都證實(shí)p93基因僅在成人及胎兒心臟表達(dá)；心肌組織的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果亦顯示p93僅在胎兒和成人心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；體外激酶活性分析

3、結(jié)果證實(shí)p93可發(fā)生自身磷酸化。 大量前期研究表明，p93是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的心肌特異性表達(dá)的有功能的蛋白激酶，推測(cè)該基因與心臟發(fā)育和心肌病關(guān)系密切，但目前尚無(wú)直接的臨床證據(jù)證明p93與心血管疾病之間存在的緊密聯(lián)系；該基因的作用機(jī)制和激酶通路也不甚明了；也無(wú)恰當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型來(lái)直觀、有效地闡明該基因在心臟發(fā)育中的作用及其機(jī)制。為解決上述問(wèn)題，本課題分別在血清學(xué)水平、細(xì)胞學(xué)水平和整體水平對(duì)p93基因的功能進(jìn)行了更深入的研究與探討：

4、1.p93血清水平的測(cè)定及其臨床意義首先建立了一個(gè)準(zhǔn)確性高、可信度大、重復(fù)性好的ELISA實(shí)驗(yàn)條件，在此基礎(chǔ)上檢測(cè)正常人、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、擴(kuò)張性心肌病、風(fēng)濕性心臟病和先天性心臟病患者的p93血清水平并比較其差異，結(jié)果顯示正常人和患者血清中均可檢測(cè)到P93抗原，說(shuō)明正常和疾病狀態(tài)下均有P93分泌入血；冠心病等4種心血管疾病患者的p93血清水平均高于正常對(duì)照組；先心病組p93血清水平高于冠心病組。最后，得出如下結(jié)論：p93基因與冠

5、狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、擴(kuò)張性心肌病、風(fēng)濕性心臟病和先天性心臟病密切相關(guān)，可能在上述各疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。 2.p93基因的信號(hào)通路與在心肌細(xì)胞凋亡中的作用培養(yǎng)原代新生大鼠心室肌細(xì)胞，感染攜帶有p93、反義p93、p93突變體重組腺病毒和空載體腺病毒48h后，可見(jiàn)Ad-p93組損傷不明顯，而其它病毒感染組均有不同程度損傷。上述細(xì)胞經(jīng)Hoechest染色顯示Ad-p93組只有輕度的染色質(zhì)邊集，其它病毒感染組心肌細(xì)胞

6、均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞核的固縮、染色質(zhì)邊集、核碎裂現(xiàn)象，有少量細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡小體結(jié)構(gòu)，說(shuō)明p93基因具有抑制凋亡的作用。收集感染后細(xì)胞蛋白經(jīng)WesternBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)JNKs和p38磷酸化蛋白量是一致的，而Ad-p93組磷酸化ERKs蛋白量增高，表明p93基因過(guò)表達(dá)引起ERK通路磷酸化水平提高，其它通路磷酸化水平無(wú)明顯差異。故得出以下結(jié)論：p93基因可能對(duì)心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用；P93激酶的下游通路是ERK通路，其通過(guò)磷酸化ER

7、K通路來(lái)達(dá)到抑制凋亡、保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。 3.利用雞胚模型初探p93基因在心臟發(fā)育過(guò)程中的作用首先，成功建立了一套成熟的雞胚培養(yǎng)條件和雞胚心臟顯微注射的技術(shù)平臺(tái)，為本課題組后期心臟發(fā)育的研究提供了一種簡(jiǎn)便實(shí)用的技術(shù)手段。通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)雞來(lái)源的、與人p93基因高度同源的預(yù)測(cè)基因，但是經(jīng)反復(fù)WesternBlot實(shí)驗(yàn)只檢測(cè)到一條與預(yù)測(cè)基因大小(190.7KD)不一致的蛋白條帶(約為80KD)，該條帶經(jīng)質(zhì)譜分析，結(jié)果顯