p63特異性共調(diào)節(jié)因子的分離與功能初步研究.pdf

1、P53(protein53)是1979年發(fā)現(xiàn)的與SV40(simian vacuolating virus40)大T抗原相互作用的蛋白,具有抑制腫瘤發(fā)生的作用[1]。其家族成員有p53、p73。1998年,p63作為新的p53家族成員被證明[2]。它與p53結(jié)構(gòu)非常相似,推測p63在人類腫瘤中可能起著與p53相似的作用[3-6]。全長p63可與經(jīng)典p53 DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合并激活p53相關(guān)啟動子,如p21、HDM2(Human doub

2、le mimute2)、Bax(Bcl2-associated X protein)等,提示p63可能參與調(diào)控p53的穩(wěn)定性和凋亡的功能[7,8]。而在生長發(fā)育方面,p63基因缺失的小鼠表現(xiàn)為外胚層發(fā)育障礙而非腫瘤易感傾向。p63活性的發(fā)揮與調(diào)節(jié)依賴于與其它蛋白質(zhì)的相互作用[9],這些與p63結(jié)合的蛋白質(zhì)被稱為p63共調(diào)節(jié)因子,研究這些共調(diào)節(jié)因子有助于深入闡明p63的功能。在實(shí)驗(yàn)室前期工作中,以TAp63α為誘餌質(zhì)粒,利用酵母雙雜交技術(shù)

3、從乳腺cDNA文庫[10]篩選出 p63和新蛋白NipSnap同源物3A(protein NipSnap homolog3A,NIPSNAP3A)有相互作用。
　　NIPSNAP3A是近年來新發(fā)現(xiàn)的功能尚未明確的蛋白,它是NIPSNAP家族成員之一,它在多種組織細(xì)胞,如腎上腺、乳腺、肝臟、骨骼肌、子宮頸以及心肌[11]等中表達(dá)。對于NIPSNAP家族成員的研究工作較少,通過基因序列比對,發(fā)現(xiàn)與組成細(xì)胞囊泡的蛋白有較高同源性[12]

4、,因此推測它們可能在細(xì)胞囊泡運(yùn)輸中發(fā)揮作用。但NIPSNAP3A與p63的相互作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證,這種相互作用的生物學(xué)功能及機(jī)制都有待探討。于是展開以下實(shí)驗(yàn)。
　　首先回轉(zhuǎn)驗(yàn)證TAp63α-ST與NIPSNAP3A的相互作用,構(gòu)建相關(guān)表達(dá)載體,通過GST(Glutathione S-Transferase)pull down及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NIPSNAP3A和p63有相互作用,而與p53和p73沒有相互作用,并且通過GST

5、pull down實(shí)驗(yàn)確定相互作用區(qū)域。發(fā)現(xiàn)NIPSNAP3A上的1-144AA區(qū)域與p63發(fā)生相互作用;p63上TA(transactivation domain)domain與NIPSNAP3A有相互作用。其次,通過轉(zhuǎn)錄活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),過表達(dá)NIPSNAP3A會抑制p63介導(dǎo)的p21和HDM2的轉(zhuǎn)錄活性,其中對HDM2的影響更明顯,并且有劑量依賴效應(yīng)。而在敲低NIPSNAP3A的情況下,其對P63靶基因轉(zhuǎn)錄活性的降低會減弱。最后,通過

6、EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay)和ChIP(Chromatin Immunoprecipitation)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了NIPSNAP3A與p63的相互作用,并且這種相互作用可以抑制p63與下游啟動子的結(jié)合。
　　總之,篩選到的NIPSNAP3A與p63相互作用能夠影響p63的下游信號分子的轉(zhuǎn)錄活性,同時也影響 p63與啟動子的結(jié)合。這可能影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為。對于闡明p63的