立氏立克次體外膜蛋白B基因的應(yīng)用研究.pdf

1、立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)是落基山斑點(diǎn)熱(Rocky Mountain SpottedFever，RMSF)的病原體，為專性細(xì)胞內(nèi)寄生的小革蘭氏陰性菌，人對(duì)其十分易感。外膜蛋白B(rOmpB)是立氏立克次體最主要的表面蛋白抗原，被認(rèn)為是發(fā)展落基山斑點(diǎn)熱診斷試劑和亞單位疫苗的靶分子。 本研究首先依據(jù)立氏立克次體ompB基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，以克隆的ompB基因片段為DNA模板，在ABI 79

2、00型熒光定量PCR檢測(cè)儀上建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。建立的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與模板拷貝數(shù)呈良好線性關(guān)系，最低檢測(cè)濃度為5拷貝/μl，與普通PCR相比較，敏感性是普通PCR的100倍；用該方法檢測(cè)其它相關(guān)立克次體和常見非立克次體病原菌，檢出結(jié)果均為陰性。用該熒光定量PCR方法檢測(cè)立氏立克次體感染的豚鼠血液標(biāo)本、小鼠脾臟標(biāo)本及細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本，檢測(cè)的結(jié)果與立氏立克次體感染進(jìn)程相關(guān)。表明本研究建立的檢測(cè)立氏立克次體實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具

3、有高特異性和高敏感性，適用于定量檢測(cè)各種樣本中的立氏立克次體和立氏立克次體感染早期的實(shí)驗(yàn)室診斷。 本研究還克隆表達(dá)了rOmpB的主要抗原片段-120kDa表面蛋白，并對(duì)重組蛋白的免疫原性和抗原性進(jìn)行了研究。利用抗原表位預(yù)測(cè)技術(shù)，將120kDa蛋白分為抗原表位比較集中的六段蛋白，通過優(yōu)化條件，利用不含胰化蛋白胨的新型MDG培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)了120kDa蛋白和六個(gè)蛋白片段在大腸桿菌的表達(dá)。免疫印跡分析證明重組蛋白中僅120kDa重組蛋白和

4、5號(hào)蛋白(P5)能與立氏立克次體免疫血清特異反應(yīng)。 用純化的七個(gè)重組蛋白免疫小鼠，IFA檢測(cè)表明120kDa和P5蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性：IgG抗體。對(duì)免疫小鼠的脾臟做體外淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)120kDa蛋白和P5蛋白能誘導(dǎo)較高水平的淋巴細(xì)胞增殖。采用RT-PCR方法檢測(cè)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞被不同蛋白抗原刺激后的細(xì)胞因子表達(dá)，發(fā)現(xiàn)120kDa蛋白和P5蛋白刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞均表達(dá)了IFN-γ、IL-2、IL-4和I

5、L-10。結(jié)果證明120kDa，蛋白和P5蛋白均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有良好的免疫原性。對(duì)重組蛋白免疫的小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，攻毒試驗(yàn)后小鼠主要臟器內(nèi)病原體載量的定量檢測(cè)結(jié)果表明，120kDa和P5重組蛋白組與滅活全菌抗原組之間沒有顯著性的差別，顯示了良好的免疫保護(hù)性。 120kDa蛋白和P5蛋白可與立克次體屬的多種立克次體免疫血清發(fā)生交叉反應(yīng)，與貝氏柯克斯體、恙蟲病東方體不反應(yīng)，提示這兩種蛋白具有