梅毒螺旋體外膜蛋白核酸疫苗的篩選構(gòu)建及其免疫效果的比較研究.pdf

1、目的：篩選比較梅毒螺旋體(Treponemapallidum，Tp)各外膜蛋白的抗原性和同源性，分別構(gòu)建真核表達(dá)重組體pcDNA3.1(+)-Gpd、pcDNA3.1(+)-Tp92和雙基因融合表達(dá)重組體pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92，檢測(cè)其所誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，比較單基因核酸疫苗和雙基因融合核酸疫苗的免疫效果，為研制高效、新型的Tp核酸疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！　》椒ǎ河肞CGENE軟件分析Tp外膜蛋白Gpd和

2、Tp92基因序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)特異性引物，PCR分別擴(kuò)增上述兩基因1059bp和2103bp的目的基因片段，將其插入pUCm-T載體，通過(guò)藍(lán)白斑初篩，酶切分析、PCR及測(cè)序鑒定篩選陽(yáng)性重組體；將Gpd和Tp92基因亞克隆至真核表達(dá)載體構(gòu)建pcDNA3.1(+)-Gpd、pcDNA3.1(+)-Tp92和pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92重組體，并分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)及westernblot鑒定其在真核細(xì)胞的表達(dá)；分別在

3、0、2、4、8w將核酸疫苗pcDNA3.1(+)-Gpd、pcDNA3.1(+)-Tp92、pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92及對(duì)照空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)分組注射于新西蘭兔后腿股四頭肌，每次劑量為100μg，末次免疫后2w，無(wú)菌分離兔脾細(xì)胞，經(jīng)特異性重組蛋白抗原刺激后，ELISA雙抗體夾心法測(cè)定培養(yǎng)上清中IFN-γ水平，ELISA間接法測(cè)定新西蘭兔血清中抗Gpd和抗Tp92特異性抗體水平；MTT法、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)測(cè)定脾淋巴

4、細(xì)胞特異性增殖反應(yīng)。　　結(jié)果：成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-Gpd和pcDNA3.1(+)-Tp92單基因真核表達(dá)載體及pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92融合基因真核表達(dá)載體，三重組質(zhì)粒均能在HeLa細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)靶蛋白。新西蘭兔接種Gpd或Tp92單基因核酸疫苗后均能產(chǎn)生特異性抗體，6w后經(jīng)ELISA測(cè)定抗體最高滴度均達(dá)1：1024，兩組抗體A450值(0.82：0.78)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。新西蘭兔接種Gpd-

5、Tp92融合基因核酸疫苗后，能產(chǎn)生特異性抗體，6w后抗體ELISA最高滴度達(dá)1：1024，A450值(0.86)與兩單基因疫苗組A450值(0.82、0.76)均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。Gpd、Tp92單基因核酸疫苗組和Gpd-Tp92融合基因核酸疫苗組的兔脾淋巴細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)特異性抗原刺激后，培養(yǎng)上清中IFN-γ均顯著升高(分別升至476±38.624pg/mL、483±38.884pg/mL、543±41.625pg/mL)，與空

6、質(zhì)粒組兔脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平(87±13.635pg/mL)之間有顯著性差異(P＜0.01)；實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(49.5％、52.8％、58.5％)均高于對(duì)照組(24.6％)。Gpd、Tp92單基因核酸疫苗組和Gpd-Tp92融合基因核酸疫苗組兔脾淋巴細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)特異性抗原刺激后其刺激指數(shù)分別為(2.58±0.46、2.34±0.43、3.17±0.52)，均明顯高于對(duì)照組(1.57±0.28)(P＜0.05)?！　〗Y(jié)