梅毒螺旋體兔感染模型構(gòu)建及臨床梅毒螺旋體菌株分離.pdf

1、目的：
　　本研究主要是建立梅毒螺旋體菌株接種到兔睪丸內(nèi)進(jìn)行增殖、分離和傳代的實(shí)驗(yàn)方法。以此方法分離梅毒螺旋體臨床菌株，并按arp、tpr基因分型系統(tǒng)對(duì)所分離的臨床菌株進(jìn)行基因型的鑒定及對(duì)梅毒螺旋體阿奇霉素耐藥相關(guān)基因23SrRNA基因A2058G、A2059G突變位點(diǎn)檢測(cè)。
　　方法：
　　1.Nichols菌株接種、傳代:將凍存的梅毒螺旋體Nichols菌株復(fù)蘇后(0.5×107個(gè)/睪丸)接種于新西蘭兔的睪丸內(nèi)，動(dòng)

2、態(tài)監(jiān)測(cè)兔血清TPPA、RPR滴度變化，觀察睪丸腫脹程度。在RPR快速上升及睪丸腫脹時(shí)，將兔處死分離，從睪丸分離梅毒螺旋體。分離得到的新鮮梅毒螺旋體Nichols菌株，按0.5×107個(gè)/睪丸進(jìn)一步接種兔睪丸內(nèi);另一部分梅毒螺旋體凍存后，仍按0.5×107個(gè)/睪丸接種兔睪丸內(nèi)，同上述方法繼續(xù)檢測(cè)梅毒螺旋體在兔睪丸內(nèi)的擴(kuò)增情況，建立梅毒螺旋體Nichols菌株在新西蘭兔睪丸內(nèi)的傳代方法;
　　2.梅毒螺旋體臨床菌株的分離、接種和傳代:

3、在2014年04月至12月期間，從上海市皮膚病醫(yī)院性病科我們獲得了10例早期梅毒患者可能含有梅毒螺旋體的標(biāo)本（其中硬下疳來源2份、扁平濕疣來源6份、腦脊液來源1份、淋巴結(jié)來源1份）。將收集的新鮮皮損滲出物接種至新西蘭兔睪丸內(nèi)，按建立的梅毒螺旋體Nichols菌株接種傳代的方法保存及傳代臨床菌株。
　　3.梅毒螺旋體臨床菌株基因型鑒定:使用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒抽提采集的臨床標(biāo)本中的梅毒螺旋體DNA，以普通PC

4、R擴(kuò)增arp基因，巣式PCR技術(shù)擴(kuò)增tpr、23S rRNA基因。以MseI限制性內(nèi)切酶tpr基因擴(kuò)增產(chǎn)物、以BsaⅠ及MboⅡ酶切23S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)合PCR及酶切結(jié)果，分析各菌株arp、tpr的分子分型特征及對(duì)阿奇霉素的敏感性。
　　結(jié)果：
　　1.梅毒螺旋體Nichols菌株接種后，兔睪丸出現(xiàn)紅腫、脹大，局部大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);復(fù)蘇梅毒螺旋體Nichols菌株接種平均5天兔血清TPPA轉(zhuǎn)陽，平均7天血清RPR

5、轉(zhuǎn)陽;直接傳代Nichols菌株接種平均6天兔血清TPPA轉(zhuǎn)陽，平均10.3天血清RPR轉(zhuǎn)陽。提示:Nichols菌株在兔睪丸內(nèi)能穩(wěn)定擴(kuò)增和傳代。
　　2.我們成功分離了10株梅毒螺旋體臨床菌株，梅毒患者來源的標(biāo)本接種到兔睪丸，20.9±11.5天出現(xiàn)兔血清TPPA陽性，29.3±11.9天兔血清RPR陽性，接種睪丸腫大，局部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。我們進(jìn)一步將獲得臨床菌株進(jìn)行傳代，6.4±4.5天出現(xiàn)兔血清TPPA陽性，13.8±5.5天

6、兔血清RPR陽性。提示:通過接種兔睪丸的方法能成功分離梅毒螺旋體臨床菌株并能穩(wěn)定傳代，但各株臨床菌株在兔體內(nèi)的擴(kuò)增及反應(yīng)差異明顯。
　　3.我們依據(jù)arp、tpr基因分型系統(tǒng)成鑒定了5株梅毒螺旋體臨床菌株，其基因型均為14d;23SrRNA基因中都均A2058G點(diǎn)突變，而無A2059G點(diǎn)突變。
　　結(jié)論：
　　1.通過兔睪丸接種的方法，梅毒螺旋體Nichols菌株在兔睪丸內(nèi)能擴(kuò)增、并能通過此方法進(jìn)行傳代;
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