鉤端螺旋體外膜脂蛋白Loa22的克隆、表達及免疫保護性研究.pdf

1、目的:構建鉤端螺旋體外膜脂蛋白Loa22基因的原核表達載體pQE31-Loa22,并在大腸桿菌M15中誘導表達目的蛋白。Loa22蛋白免疫豚鼠,研究其在豚鼠體內(nèi)產(chǎn)生的的體液免疫和細胞免疫應答水平,并通過體內(nèi)外試驗檢測其免疫保護性,為研制鉤端螺旋體疫苗奠定實驗基礎。
　　方法:以賴型鉤端螺旋體56601株基因組為模板,聚合酶鏈反應(PCR)擴增大小為516 bp的目的基因片段。Loa22基因克隆至原核表達載體,構建pQE31-Loa

2、22。重組質(zhì)粒雙酶切和測序鑒定。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 M15中誘導表達目的蛋白。SDS-PAGE、Western-blot鑒定目的蛋白。于0 w、2 w、4 w將蛋白及對照PBS分別經(jīng)豚鼠腹股溝、腋下、背部多處免疫豚鼠。末次免疫后2 w,用培養(yǎng)7d的56601株鉤端螺旋體從腹腔攻擊各免疫組豚鼠(1mL/只)。連續(xù)觀察15天,觀察各免疫組豚鼠發(fā)病情況,并取各免疫組豚鼠的肺、肝、腎做病理切片,HE染色觀察比較各免疫組豚鼠的組織病理變化。分

3、析蛋白Loa22對豚鼠的免疫保護作用。ELISA法測定各免疫組豚鼠血清中抗體水平。無菌分離豚鼠脾淋巴細胞,MTT比色法檢測各免疫組豚鼠脾淋巴細胞的體外增殖反應,計算刺激指數(shù)。ELISA測定Loa22蛋白抗血清與致病性鉤端螺旋體56607、56603、56609株的交叉免疫反應。通過Fontana鍍銀染色法檢測Loa22蛋白抗血清對鉤端螺旋體56601株黏附Raw264.7細胞的阻斷情況。
　　結果:PCR擴增出為516bp的目的片

4、段。重組質(zhì)粒經(jīng)測序和雙酶切鑒定構建成功。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入 M15后,SDS-PAGE、Western-blot檢測目的基因能表達 Mr為22KD的蛋白。豚鼠接種Loa22蛋白后產(chǎn)生了特異性抗體,末次免疫后2 w豚鼠血清抗體最高滴度均達到了1:8000,而接種PBS的豚鼠血清中無特異性抗體。蛋白免疫組豚鼠脾淋巴細胞在體外經(jīng)蛋白刺激后刺激指數(shù)(3.25±0.37)明顯高于 PBS對照組(1.38±0.13)。Loa22蛋白免疫的豚鼠用5660

5、1株鉤體攻擊,經(jīng)實驗觀察無發(fā)病現(xiàn)象,HE染色顯示各組織沒有病理改變。而PBS免疫的豚鼠在實驗中不同程度的出現(xiàn)食欲不振、活動減少等現(xiàn)象,HE染色顯示各組織均有明顯的病理改變。Loa22蛋白抗血清與致病性鉤體56607、56603和56609株具有良好的交叉免疫反應(效價為1/409600、1/819200、1/3376800)。Loa22蛋白抗血清稀釋比率為1:50時黏附抑制率為90％,稀釋比率為1:400時黏附抑制率為50%。
　

6、　結論:
　　(1)成功擴增了Loa22基因,并成功構建了原核表達載體pQE31-Loa22。并在大腸桿菌M15表達出Mr約為22KD的重組蛋白。
　　(2) Loa22蛋白在豚鼠體內(nèi)可誘導較強的特異性體液免疫和細胞免疫應答。
　　(3) Loa22蛋白在豚鼠體內(nèi)誘生的免疫應答能抵抗同型鉤體感染。
　　(4) Loa22蛋白抗血清與不同血清型鉤體具有交叉免疫反應。
　　(5) Loa22蛋白抗血清能夠阻斷鉤