人原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨間充質(zhì)祖細(xì)胞生物學(xué)特性研究.pdf

1、課題背景：OA是醫(yī)學(xué)臨床最常見的骨關(guān)節(jié)疾病，為目前導(dǎo)致中老年人殘障的第二大病因(僅次于心腦血管疾病)。OA分為原發(fā)性(特發(fā)性)和繼發(fā)性兩類。研究表明，原發(fā)性O(shè)A是關(guān)節(jié)軟骨損傷與修復(fù)失衡所致；MSCs具有自我更新和多向分化潛能，在一定條件下被激活后，可大量增殖并向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等方向分化，在維持組織自身穩(wěn)定和修復(fù)病變組織中起著至關(guān)重要的作用；bFGF和TGF-β1具有顯著的促M(fèi)SCs增殖的作用；核結(jié)合蛋白SOX6和SOX9是

2、誘導(dǎo)MSCs成軟骨分化相關(guān)基因表達(dá)的必要因子，是成軟骨分化的關(guān)鍵開關(guān)。新近研究發(fā)現(xiàn)正常入和原發(fā)性O(shè)A患者關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)存在具有MSCs特性的MPCs，且原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)MPCs的數(shù)量較正常關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)MPCs增多。而原發(fā)性O(shè)A和正常人關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)MPCs的生長和增殖特性及其成軟骨、成骨和成脂分化能力，以及在原發(fā)性O(shè)A發(fā)生和發(fā)展中起的作用如何；bFGF和TGF-pi對(duì)關(guān)節(jié)軟骨MPCs的促增殖作用，SOX6和SOX9對(duì)MPCs的成軟骨分化作用，

3、目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道。因此，觀察比較原發(fā)性O(shè)A及正常人關(guān)節(jié)軟骨MPCs的生長和增殖特性及其成軟骨、成骨和成脂分化能力及其在關(guān)節(jié)軟骨退變及原發(fā)性O(shè)A發(fā)生和發(fā)展中的作用，可為探討關(guān)節(jié)軟骨退變及原發(fā)性O(shè)A發(fā)病的機(jī)制提供新思路：同時(shí)觀察相關(guān)生物因子對(duì)OA關(guān)節(jié)軟骨MPCs的促增殖和成軟骨分化的作用，可為通過調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨MPCs以防治原發(fā)性O(shè)A提供理論依據(jù)。 目的：觀察比較原發(fā)性O(shè)A及正常人關(guān)節(jié)軟骨MPCs的生長和增殖特性及其成軟骨、成骨

4、和成脂分化能力，明確關(guān)節(jié)軟骨MPCs在原發(fā)性O(shè)A發(fā)病中的重要作用；觀察bFGF和TGF-β1對(duì)原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨MPCs的促增殖作用，以及SOX6和SOX9對(duì)其MPCs的成軟骨分化作用，為通過調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨MPCs以防治原發(fā)性O(shè)A提供理論依據(jù)。 方法： 1.采用改良酶消化分離法觀察比較原發(fā)性O(shè)A及正常人關(guān)節(jié)軟骨單位濕重的細(xì)胞含量。采用免疫磁珠法，以CD105、CD166為標(biāo)志物，分別于原代培養(yǎng)原發(fā)性O(shè)A及正常人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞

5、中，分選其關(guān)節(jié)軟骨MPCs，并分別計(jì)算其陽性細(xì)胞比率和存活率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選細(xì)胞表面的分子表型，對(duì)比觀察原發(fā)性O(shè)A及正常人關(guān)節(jié)軟骨MPCs的細(xì)胞數(shù)量、生長特性、細(xì)胞增殖的變化。 2.觀察原發(fā)性O(shè)A及正常人關(guān)節(jié)軟骨MPCs成軟骨(微團(tuán)培養(yǎng))誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形態(tài)變化，TB、II型膠原、aggrecan染色，GAG含量及II型膠原mRNA表達(dá)；成骨(單層傳代培養(yǎng))誘導(dǎo)分化后細(xì)胞形態(tài)變化，鈣結(jié)節(jié)染色，ALP活性及BGPmRNA表達(dá)；

6、成脂(單層傳代培養(yǎng))誘導(dǎo)分化后細(xì)胞形態(tài)變化，油紅染色，油紅染色陽性細(xì)胞比率及TG含量。 3.采用MTT法測(cè)定不同濃度bFGF和TGF-β1單獨(dú)或聯(lián)合作用下對(duì)原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨MPCs的增殖作用。分別以pAdTrack-CMV-SOX6、SOX9腺病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建SOX6、SOX9基因，并感染原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨MPCs，比較基因感染組和未感染組成軟骨誘導(dǎo)分化后，TB、Ⅱ型膠原以及II型膠原mRNA表達(dá)的變化。 結(jié)果：

7、 1.原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨單位濕重的細(xì)胞含量為1.55±0.16(106個(gè)細(xì)胞/g)僅為正常人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)(3.57±0.18)的41.3％。原發(fā)性O(shè)A及正常人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的CD105+細(xì)胞比率分別為95.7±1.16、95.2±1.18(％)，CD166+為6.8±0.26、6.6±0.19，CD105+/CD166+為4.5±0.09、4.6±0.07，二者之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均>0.05)；分選細(xì)胞存活率為93-95(％)

8、；經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，其分選原發(fā)性O(shè)A及正常人關(guān)節(jié)軟骨MPCs的CD105+分別為96.5±1.12、95.5±1.16，CD166+為96.8±1.26、97.5±1.31，CD105+/CD166+細(xì)胞分別為93.5±1.09、94.6±1.13，而CD34+、CD45+細(xì)胞僅為0.5±0.012、0.4±0.01及0.8±0.014、0.6±0.011。與正常人關(guān)節(jié)軟骨MPCs比較，原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨MPCs的生長速度和增殖速率較快

9、。 2.原發(fā)性O(shè)A及正常人關(guān)節(jié)軟骨MPCs成軟骨誘導(dǎo)分化后細(xì)胞TB、Ⅱ型膠原、aggrecan染色均呈陽性，原發(fā)性O(shè)A者GAG含量減少及II型膠原mRNA表達(dá)減弱(P<0.05)：成骨誘導(dǎo)分化后細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)染色均呈陽性，原發(fā)性O(shè)A者ALP含量減少及BGPmRNA表達(dá)減弱(P<0.05)；成脂誘導(dǎo)分化后細(xì)胞油紅染色均呈陽性，原發(fā)性O(shè)A者TG含量增加(P<0.05)。 3.10～50ng/ml的bFGF、0.1-1.0ng/m

10、l的TGF-β1單獨(dú)作用于傳代培養(yǎng)原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨MPCs時(shí)，其培養(yǎng)細(xì)胞的增殖速率顯著增加(P<0.05)，而隨著二者濃度的進(jìn)一步增加，其增殖速率無顯著變化(P>0.05)； bFGFlOng/ml+TGF-β1.0ng/ml聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨MPCs具有明顯促增殖作用(P<0.05)。SOX6和SOX9能夠分別穩(wěn)定感染OA關(guān)節(jié)軟骨MPCs；經(jīng)二者分別感染的關(guān)節(jié)軟骨MPCs成軟骨誘導(dǎo)分化后，其TB染色、Ⅱ型膠原染色呈強(qiáng)陽

11、性表達(dá)，未基因感染細(xì)胞為弱陽性著色；SOX6基因感染原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨MPCs的Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)量為未基因感染細(xì)胞的3.8倍(P<0.01)，SOX9基因?yàn)槲锤腥炯?xì)胞的5.15倍(P<0.01)。 結(jié)論： 1.原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的細(xì)胞含量顯著少于正常人關(guān)節(jié)軟骨。原發(fā)性O(shè)A及正常人關(guān)節(jié)軟骨存在MPCs；相同數(shù)量的原發(fā)性O(shè)A及正常人關(guān)節(jié)軟骨中分選出的關(guān)節(jié)軟骨MPCs數(shù)量相同。原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨MPCs的生長與增殖較正常

12、入關(guān)節(jié)軟骨MPCs活躍。據(jù)此推測(cè)單位體積關(guān)節(jié)軟骨中，原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨MPCs數(shù)量可能明顯少于正常人關(guān)節(jié)軟骨，并提示關(guān)節(jié)軟骨MPCs在原發(fā)性O(shè)A病理過程中具有重要作用。 2.關(guān)節(jié)軟骨MPCs經(jīng)成軟骨、成骨及成脂誘導(dǎo)后均能分化為具有相應(yīng)功能細(xì)胞特性的分化細(xì)胞；原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨MPCs成軟骨和成骨分化能力降低，而成脂分化能力增加，提示原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨MPCs分化功能出現(xiàn)異常，OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞對(duì)軟骨損傷修復(fù)能力降低。 3.