調(diào)控VEGF與Notch信號(hào)通路對(duì)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　骨關(guān)節(jié)炎是一種骨科常見(jiàn)病，在老年人中發(fā)病率較高，其主要病理改變是關(guān)節(jié)軟骨損傷退變。由于軟骨組織是一種無(wú)血液供應(yīng)、無(wú)神經(jīng)及淋巴組織分布的組織，因此自我修復(fù)能力較差。骨關(guān)節(jié)炎的主要癥狀是關(guān)節(jié)疼痛和活動(dòng)度受限，影響病人日常生活，甚至導(dǎo)致喪失勞動(dòng)能力，給家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重的社會(huì)負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前治療骨關(guān)節(jié)炎的方法有限，最有效的方法是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)。但由于該手術(shù)的花費(fèi)較高，且不可避免假體松動(dòng)、下沉等遠(yuǎn)期并發(fā)癥。如能探索出更

2、為簡(jiǎn)單有效的治療方法具有良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是一種來(lái)源于中胚層的干細(xì)胞，具有多向分化潛能，目前廣泛應(yīng)用于組織工程及再生醫(yī)學(xué)。而應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)軟骨組織具有較好的應(yīng)用前景，已有研究顯示關(guān)節(jié)腔注射 MSCs可修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎的軟骨缺損。MSCs治療骨關(guān)節(jié)炎軟骨缺損的關(guān)鍵是將MSCs分化為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，如果能促進(jìn) MSCs軟骨分化則可促進(jìn)其對(duì)軟骨缺損的修復(fù)

3、作用。胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（Placenta Derived Mesenchymal Stem Cells，PMSCs）是一種胎盤來(lái)源的MSCs。由于其來(lái)源于胚胎組織，具有更高的增值活性及分化能力。如果將PMSCs應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎的軟骨修復(fù)則能有更好的結(jié)果。
　　有研究顯示在胚胎肢體發(fā)育過(guò)程中，抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）表達(dá)可促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向軟骨組織分化，而在成

4、體干細(xì)胞中也有研究顯示抑制 VEGF表達(dá)可促進(jìn)其軟骨分化，并能促進(jìn)干細(xì)胞對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨缺損的修復(fù)。而在干細(xì)胞軟骨分化過(guò)程中有多種信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)，其中最重要的是Notch信號(hào)通路，但其具體作用機(jī)制尚未明確。因此本研究設(shè)想主動(dòng)調(diào)控Notch信號(hào)通路，觀察其對(duì)PMSCs軟骨分化的影響，尋找出能促進(jìn)PMSCs軟骨分化的調(diào)控方法。然后采用聯(lián)合調(diào)控VEGF與Notch信號(hào)通路的方法促進(jìn) PMSCs的軟骨分化，進(jìn)一步將其運(yùn)用到內(nèi)側(cè)半月板切除（Des

5、tabilization of the Medial Meniscus，DMM）骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中，觀察其對(duì)軟骨修復(fù)的作用。
　　研究目的
　　首先觀察不同Notch信號(hào)通路調(diào)控方式對(duì)PMSCs軟骨分化的影響，尋找出能促進(jìn)PMSCs軟骨分化的調(diào)控方式。然后采用聯(lián)合調(diào)控VEGF與Notch信號(hào)通路的方法，觀察其對(duì)PMSCs軟骨分化的影響。構(gòu)建小鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，將聯(lián)合調(diào)控VEGF與Notch信號(hào)通路的PMSCs注射入關(guān)節(jié)腔

6、，觀察其對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的效果，為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供新的理論支持。本研究分為以下三個(gè)部分：
　　第一部分：調(diào)控VEGF與Notch信號(hào)通路對(duì)PMSCs軟骨分化的影響
　　方法：
　?。?）培養(yǎng) PMSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原 CD29，CD34、CD73、CD90、CD105、CD166的表達(dá)。
　　（2）分別應(yīng)用成骨、成脂及成軟骨分化培養(yǎng)基誘導(dǎo) PMSCs分化，觀察其多向分化潛能。堿性磷酸酶染色、茜

7、素紅染色及Runx2、Osteocalcin基因表達(dá)水平鑒定其成骨分化能力；油紅O染色，PPARγ、C/EBPa基因表達(dá)水平鑒定其成脂分化能力；阿利新藍(lán)染色、II型膠原（Col-II）免疫組織化學(xué)染色及Aggrecan、Col-II及Sox9基因表達(dá)水平鑒定其成軟骨分化能力。
　?。?）應(yīng)用VEGF受體抑制劑SU5416抑制VEGF信號(hào)通路，觀察其對(duì)PMSCs軟骨分化的影響。
　　（4）應(yīng)用Notch信號(hào)通路抑制劑 LY41

8、1575抑制 Notch信號(hào)通路及 Notch信號(hào)通路配體蛋白Jagged1激活Notch信號(hào)通路，觀察其對(duì)PMSCs軟骨分化的影響。根據(jù)處理方式不同，實(shí)驗(yàn)分為6組：①正常對(duì)照組；②Notch7d組：在分化前7天添加Notch信號(hào)通路抑制劑LY411575；③Notch21d組：在分化全過(guò)程（21天）添加LY411575；④Jag17d組：在分化前7天添加Jagged1蛋白；⑤Jag121d組：在分化全過(guò)程添加Jagged1蛋白；⑥Ja

9、g17d+Notch14d組：分化前7天添加Jagged1蛋白+分化后14天添加LY411575。
　　（5）聯(lián)合調(diào)控VEGF與Notch信號(hào)通路，觀察其對(duì)PMSCs軟骨分化的影響，實(shí)驗(yàn)分為4組：①正常對(duì)照組；②VEGFRi組：分化全過(guò)程添加VEGF受體抑制劑SU5416；③Jag17d組：分化前7天添加Jagged1蛋白；④VEGFRi+Jag17d組：分化全過(guò)程添加SU5416+分化前7天添加Jagged1蛋白。
　　結(jié)

10、果：
　?。?）流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志物結(jié)果顯示，PMSCs表達(dá) CD29、CD73、CD90、CD105、CD166，陽(yáng)性率分別為100％、100%、100%、54.7%、93.1%，不表達(dá)CD34，陽(yáng)性率為0%。
　?。?）經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)，PMSCs可成功分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞，證實(shí)PMSCs具有多向分化潛能。
　?。?）抑制VEGF信號(hào)通路后，Pellet內(nèi)阿利新藍(lán)染色陽(yáng)性區(qū)域及Col-II蛋白的表達(dá)水平比

11、對(duì)照組高。軟骨標(biāo)志基因Col-II、Aggrecan、Sox9的表達(dá)量較對(duì)照組升高。證實(shí)抑制VEGF信號(hào)通路可促進(jìn)PMSCs的軟骨分化。
　　（4）應(yīng)用不同方法調(diào)控Notch信號(hào)通路后發(fā)現(xiàn)，Notch7d組、Notch21d組與Jag17d+Notch14d組均明顯抑制PMSCs的軟骨分化。Jag121d組的軟骨分化水平與正常組無(wú)明顯差異。Jag17d組的PMSCs軟骨分化水平明顯高于對(duì)照組。證實(shí)早期激活Notch信號(hào)通路可促進(jìn)P

12、MSCs的軟骨分化，而抑制Notch信號(hào)通路可明顯抑制其分化，無(wú)論抑制時(shí)間長(zhǎng)短。
　?。?）聯(lián)合調(diào)控VEGF與Notch信號(hào)通路后發(fā)現(xiàn)，VEGFRi+Jag17d組的軟骨分化水平高于VEGFRi組與Jag17d組。證實(shí)聯(lián)合調(diào)控VEGF信號(hào)通路與Notch信號(hào)通路對(duì)PMSCs的軟骨分化有協(xié)同作用。
　　第二部分：小鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型的構(gòu)建
　　方法：
　?。?） DMM手術(shù)操作：取大腿外側(cè)切口，用顯微外科剪沿髕韌

13、帶內(nèi)緣剪開(kāi)關(guān)節(jié)囊，分離周圍軟組織，完整切除內(nèi)側(cè)半月板。
　　（2）標(biāo)本處理：術(shù)后4周、8周、12周各處死6只模型小鼠，另取6只正常小鼠做對(duì)照。解剖雙下肢，福爾馬林固定72小時(shí)。固定后脫鈣，之后石蠟包埋、切片。
　?。?）結(jié)果鑒定：H&E染色觀察膝關(guān)節(jié)整體結(jié)構(gòu)，阿利新藍(lán)染色及番紅 O染色觀察膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)情況；OARSI組織學(xué)評(píng)分評(píng)估各標(biāo)本骨關(guān)節(jié)炎程度；Col-II、Aggrecan免疫組織化學(xué)染色觀察軟骨面內(nèi)基質(zhì)蛋白表達(dá)情況

14、；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色觀察脛骨平臺(tái)軟骨下骨破骨細(xì)胞活動(dòng)情況；骨贅大小評(píng)分及骨贅成熟度評(píng)分分析各組膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)骨贅形成情況。
　　結(jié)果：
　?。?）膝關(guān)節(jié)組織學(xué)分析：DMM術(shù)后4周小鼠膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)軟骨面已有磨損，但關(guān)節(jié)面尚完整，未見(jiàn)軟骨面破裂，關(guān)節(jié)磨損處軟骨面內(nèi)蛋白多糖含量減少，呈現(xiàn)出早期骨關(guān)節(jié)炎改變。DMM術(shù)后8周時(shí)小鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨面磨損較重，軟骨面破裂，關(guān)節(jié)面不完整，殘留軟骨較少，關(guān)節(jié)軟骨面

15、內(nèi)蛋白多糖含量減少，呈現(xiàn)出典型骨關(guān)節(jié)炎改變。DMM術(shù)后12周時(shí)小鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)間隙磨損嚴(yán)重，脛骨平臺(tái)已基本無(wú)軟骨殘留，軟骨下骨裸露，脛骨平臺(tái)軟骨下骨硬化，呈重度骨關(guān)節(jié)炎改變。
　?。?）DMM術(shù)后4周組的OARSI評(píng)分為3±0.6，高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；DMM術(shù)后8周組的OARSI評(píng)分為10.8±1.3，明顯高于術(shù)后4周組（P<0.05）；DMM術(shù)后12周的OARSI評(píng)分為15.8±1.2，明顯高于術(shù)后8

16、周組（P<0.05）。證實(shí)DMM造模手術(shù)的關(guān)節(jié)退變程度呈漸進(jìn)性發(fā)展。
　　（3）正常膝關(guān)節(jié)軟骨面內(nèi)Col-2及Aggrecan蛋白表達(dá)量較高，隨著DMM手術(shù)造模時(shí)間的推移，軟骨面內(nèi)Col-2及Aggrecan的蛋白表達(dá)量逐漸減少，證實(shí)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生時(shí)伴有軟骨基質(zhì)蛋白的丟失。
　?。?）DMM造模4周時(shí)脛骨平臺(tái)軟骨下骨破骨細(xì)胞數(shù)量較多，而在術(shù)后8周時(shí)破骨細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始下降，到術(shù)后12周時(shí)恢復(fù)至正常水平。
　?。?）DMM術(shù)后

17、4周時(shí)可發(fā)現(xiàn)脛骨平臺(tái)周圍有骨贅形成，隨著造模時(shí)間的推移，骨贅逐漸增大且成熟度逐漸升高。
　　第三部分：調(diào)控VEGF與Notch信號(hào)通路對(duì)PMSCs修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎軟骨缺損的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　?。?）DMM造模：同第二部分。
　?。?）關(guān)節(jié)腔注射PMSCs：在DMM造模后4周進(jìn)行關(guān)節(jié)腔注射PMSCs治療，每周注射一次。根據(jù)細(xì)胞處理方法不同分為5組：①Control組：關(guān)節(jié)腔注射培養(yǎng)基；②PMSCs組：關(guān)節(jié)腔注射 PMSCs；③

18、P+V組：關(guān)節(jié)腔注射PMSCs+SU5416；④P+J組：關(guān)節(jié)腔注射PMSCs+Jagged1；⑤P+V+J組：關(guān)節(jié)腔注射PMSCs+SU5416+Jagged1。
　?。?）CM-Dil標(biāo)記追蹤PMSCs：用CM-Dil試劑標(biāo)記PMSCs，追蹤PMSCs注射入關(guān)節(jié)腔后生物活動(dòng)軌跡。
　　（4）標(biāo)本處理：在關(guān)節(jié)腔注射治療后4周及8周時(shí)，每組各處死6只動(dòng)物，收集雙膝關(guān)節(jié)標(biāo)本。固定后脫鈣，脫鈣14天后石蠟包埋、切片。
　　

19、（5）結(jié)果鑒定：H&E染色觀察膝關(guān)節(jié)整體結(jié)構(gòu)，阿利新藍(lán)染色及番紅 O染色觀察膝關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)情況；OARSI組織學(xué)評(píng)分評(píng)估各標(biāo)本骨關(guān)節(jié)炎治療效果；Aggrecan、Col-II、Col-X免疫組織化學(xué)染色觀察修復(fù)軟骨面內(nèi)基質(zhì)蛋白表達(dá)情況；脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）染色觀察膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　?。?）將CM-Dil標(biāo)記的PMSCs注射入DMM小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)，注射后4周時(shí)仍可見(jiàn)熒光標(biāo)

20、記的PMSCs，證實(shí)PMSCs注射后可長(zhǎng)期在關(guān)節(jié)腔內(nèi)存活。
　?。?）膝關(guān)節(jié)組織學(xué)分析：治療4周及8周后發(fā)現(xiàn)，PMSCs組膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)有軟骨修復(fù)，關(guān)節(jié)面尚光滑，未見(jiàn)軟骨破裂，但修復(fù)的軟骨層較薄，軟骨基質(zhì)較少；P+V組與P+J組膝關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)情況比PMSCs組好，軟骨較厚且軟骨基質(zhì)較多；P+V+J組軟骨修復(fù)效果最好，透明軟骨層較厚，軟骨基質(zhì)染色陽(yáng)性區(qū)域大且染色較深，明顯優(yōu)于其他各組。OARSI評(píng)分也證實(shí)了同樣的結(jié)果。
　

21、?。?）PMSCs組修復(fù)的軟骨層內(nèi)可見(jiàn)有Col-2、Aggrecan蛋白表達(dá)，但表達(dá)量較低，而退變軟骨標(biāo)志蛋白Col-X的蛋白表達(dá)量較高，證明PMSCs組修復(fù)的軟骨質(zhì)量較差。P+V組與 P+J組修復(fù)軟骨面的Col-2、Aggrecan蛋白表達(dá)量較Control組高，而Col-X的蛋白表達(dá)量較Control組低，證實(shí)P+V組與P+J組修復(fù)軟骨面的軟骨質(zhì)量較 Control組高。而 P+V+J組修復(fù)軟骨面內(nèi)的Col-2、Aggrecan蛋白

22、表達(dá)量比其他組都高，而 Col-X的蛋白表達(dá)量比其他組都低，證實(shí)P+V+J組修復(fù)軟骨質(zhì)量最高，接近于正常的軟骨組織。
　　（4）PMSCs組的TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），證實(shí)關(guān)節(jié)腔注射PMSCs可以抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。P+V組與P+J組的TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯少于PMSCs組（P<0.05）。而P+V+J組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯少于其他組（P<0.05），證實(shí) P+

23、V+J組可以更好的抑制軟骨細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：
　?。?）PMSCs具有多向分化潛能；抑制VEGF信號(hào)通路可以促進(jìn)PMSCs的軟骨分化；早期激活 Notch信號(hào)通路也可以促進(jìn)其軟骨分化；聯(lián)合調(diào)控 VEGF與Notch信號(hào)通路對(duì)PMSCs的軟骨分化有協(xié)同作用。
　　（2）DMM手術(shù)可成功構(gòu)建小鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，且病變程度呈漸進(jìn)性發(fā)展，適合用于骨關(guān)節(jié)炎研究。
　?。?）關(guān)節(jié)腔注射 PMSCs對(duì)小鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨缺