白藜蘆醇通過(guò)拮抗Aβ1-42所致SIRT1表達(dá)下調(diào)和CREB磷酸化降低保護(hù)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的功能.pdf

1、阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)是最常見(jiàn)的神退行性疾病，也是最常見(jiàn)的一種癡呆病。在65歲以上的老年人中，AD的患病率約為10％。AD主要的神經(jīng)病理改變包括細(xì)胞外的老年斑（其核心是β淀粉樣蛋白，即Aβ）、胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)，以及選擇性的神經(jīng)元和突觸聯(lián)系的消失。AD的發(fā)病機(jī)制雖然復(fù)雜，但Aβ學(xué)說(shuō)得到眾多學(xué)者的公認(rèn)，比較一致的觀點(diǎn)是Aβ的低聚物及纖維在AD發(fā)病過(guò)程發(fā)揮關(guān)鍵作用，與其他因素共同引起AD一系列的病理過(guò)程。

2、由于發(fā)病因素及病理機(jī)制復(fù)雜，目前尚無(wú)法對(duì)AD進(jìn)行有效防治。目前在臨床上雖有藥物用于治療AD，但療效均不理想。因此，基于Aβ學(xué)說(shuō)在AD發(fā)病中的重要作用，人們開(kāi)始圍繞通過(guò)減少Aβ的沉積設(shè)計(jì)新的藥物及相應(yīng)的治療方法。但就目前的研究結(jié)果來(lái)看，其療效仍不明確。需要尋找新的干預(yù)措施延緩甚至逆轉(zhuǎn)AD的病程。
　　 白藜蘆醇(Resveratrol)（反式-3,4,5’-三羥基均二苯代乙烯）是一種天然的多酚類化合物。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在70多種植物中

3、含有該化合物（如葡萄皮、堅(jiān)果、石榴等）。此外，已經(jīng)明確紅酒中的白藜蘆醇含量很高。研究證實(shí)白藜蘆醇有著極為廣泛的生物學(xué)作用，如心血管保護(hù)、抗癌、抗炎，以及神經(jīng)保護(hù)等。早期的研究結(jié)果顯示，飲用紅酒可以拮抗AD，并且減輕AD病人的認(rèn)知障礙及Aβ病理作用。進(jìn)一步的研究證實(shí)，白藜蘆醇可以拮抗Aβ的毒性作用，并且這種作用是通過(guò)直接和間接兩種途徑發(fā)揮。拮抗Aβ毒性的直接作用方式主要有，抑制Aβ的生成、抑制Aβ的纖維化及聚合、改變Aβ的構(gòu)型、促進(jìn)Aβ的

4、降解。而間接作用方式包括抗氧化和抗炎癥作用。新近的資料顯示，白藜蘆醇還可以通過(guò)激活sirtuins（又稱為SIRT，沉默信息調(diào)節(jié)因子2，屬于組蛋白脫乙?；讣易澹┌l(fā)揮保護(hù)作用。因而，近期更多的研究是致力于明確白藜蘆醇增強(qiáng)SIRT1活性，繼而引發(fā)SIRT1對(duì)細(xì)胞內(nèi)途徑的激活或調(diào)節(jié)的機(jī)制。
　　 SIRT1參與體內(nèi)多種生理功能的調(diào)節(jié)，在多種生物體模型中具有延長(zhǎng)壽命的作用，同時(shí)對(duì)多種損傷具有保護(hù)作用。而且SIRT1在神經(jīng)系統(tǒng)也發(fā)揮重要

5、作用，研究表明SIRT1對(duì)維持正常的認(rèn)知功能及突觸的可塑性非常重要。如SIRT1的激活增強(qiáng)了突觸的可塑性，而SIRT1功能的喪失，則會(huì)對(duì)突觸的可塑性過(guò)程產(chǎn)生損傷。進(jìn)一步地研究發(fā)現(xiàn)SIRT1的這種功能是通過(guò)腦內(nèi)特異的小RNA(micro-RNA)對(duì)cAMP反應(yīng)結(jié)合蛋白(CREB)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的，由此可最終產(chǎn)生對(duì)突觸可塑性，包括長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)和長(zhǎng)時(shí)記憶的影響。離體的研究也顯示，低劑量的Aβ可以降低神經(jīng)元激活誘導(dǎo)的CREB的磷酸

6、化。與上述實(shí)驗(yàn)研究相對(duì)應(yīng)的臨床檢測(cè)結(jié)果是，通過(guò)對(duì)AD患者大腦的尸檢發(fā)現(xiàn)p-CREB的水平明顯下降。因此Aβ對(duì)神經(jīng)元功能的早期損傷很可能是涉及包括CREB信號(hào)系統(tǒng)的改變。最新的報(bào)道也顯示，AD患者頂葉皮層中的SIRT1含量明顯的下降（信使RNA含量下降了29%，蛋白含量下降了45%），而且這種下降與Aβ和t蛋白在大腦皮層的聚集密切相關(guān)。
　　 綜上所述，現(xiàn)有的證據(jù)顯示：在AD病理過(guò)程中，Aβ的毒性發(fā)揮重要作用，包括可能導(dǎo)致SIRT

7、1的表達(dá)下調(diào)，同時(shí)也降低了CREB的磷酸化水平。那么白藜蘆醇是否會(huì)通過(guò)影響Aβ所致的上述病理過(guò)程發(fā)揮保護(hù)作用呢？本研究的科學(xué)假設(shè)是：白藜蘆醇可能通過(guò)抑制Aβ所致的SIRT1含量及CREB磷酸化水平的下降，拮抗Aβ造成的學(xué)習(xí)和記憶功能的損傷，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 第一部分：白藜蘆醇拮抗Aβ1-42的毒性恢復(fù)大鼠學(xué)習(xí)記憶行為的作用觀察
　　 1、研究目的
　　 Aβ的低聚物及纖維被認(rèn)為是Aβ毒性作用的關(guān)鍵因素

8、，而Aβ是導(dǎo)致AD一系列病理過(guò)程的核心環(huán)節(jié)，包括Aβ造成的AD患者學(xué)習(xí)和記憶的損傷。有報(bào)導(dǎo)顯示，白藜蘆醇可以減輕Tg2576小鼠和p25小鼠（兩種AD模型小鼠）的空間記憶損傷，也可以減輕經(jīng)側(cè)腦室注射Aβ25-35的大鼠的空間記憶損傷。為模擬AD的病理過(guò)程，我們對(duì)大鼠進(jìn)行雙側(cè)海馬注射Aβ1-42，在此基礎(chǔ)上注射白藜蘆醇，用水迷宮實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶的行為學(xué)檢測(cè)，觀察白藜蘆醇對(duì)Aβ1-42產(chǎn)生的對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶毒性作用的影響。
　　 2

9、、材料和方法
　　 成年的雄性SD大鼠（體重220-240克），隨機(jī)分成8組，n=9。處理如下：
　　 1．溶劑對(duì)照組；
　　 2.Aβ1-42(0.22nM/lpl)組；
　　 3.Resveratrol(0.05nM/lμl、0.22nM/lμl、0.44nM/lμl)組；
　　 4.Resveratrol(0.05nM/1μ1)+Aβ1-42(0.22nM/lμl)組；
　　 5.R

10、esveratrol(0.22nM/lμl)+Aβl-42(0.22nM/lμl)組；
　　 6.Resveratrol(0.44nM/lμ1)+Aβ1-42(0.22nM/lμl)組。
　　 海馬注射手術(shù)后，第8天進(jìn)行水迷宮行為檢測(cè)。
　　 3、結(jié)果
　　 (1)雙側(cè)海馬注射Aβ1-42損傷大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能
　　 在5天的學(xué)習(xí)訓(xùn)練期內(nèi)，Aβ1-42處理組大鼠的逃逸潛伏期（從入水至到達(dá)并停留在

11、平臺(tái)的時(shí)間）明顯地長(zhǎng)于溶劑對(duì)照組（p＜0.05）。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，平臺(tái)被撤去，溶劑對(duì)照組的大鼠在目標(biāo)象限(target quadrant，TQ)逗留的時(shí)間要多于其他象限。而Aβ1-42處理組大鼠在TQ逗留的時(shí)間要明顯地少于溶劑對(duì)照組的大鼠的逗留時(shí)間(p＜0.05)。
　　 (2)白藜蘆醇單獨(dú)處理不影響大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能
　　 白藜蘆醇(0.05nM，0.22 nM or 0.44 nM)單獨(dú)處理后，在學(xué)習(xí)訓(xùn)練期內(nèi)，與溶

12、劑對(duì)照組相比，沒(méi)有觀察到其對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生明顯的影響(p＞0.05)。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，也沒(méi)有觀察到其在TQ內(nèi)的逗留時(shí)間與溶劑對(duì)照組有明顯差異(p＞0.05)。
　　 (3)白藜蘆醇預(yù)處理抑制了Aβ1-42所致的大鼠學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)的改變
　　 在學(xué)習(xí)訓(xùn)練期內(nèi)，白藜蘆醇(0.05nM，0.22nM)預(yù)處理明顯地抑制了Aβ1-42對(duì)大鼠逃逸潛伏期的影響(p＜0.05)，但0.44nM白藜蘆醇預(yù)處理，卻沒(méi)有觀察到這一作

13、用(p>0.05)。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與Aβ1-42處理組的大鼠相比，白藜蘆醇(0.05nM，0.22nM)預(yù)處理組的大鼠在TQ逗留的時(shí)間明顯延長(zhǎng)(p<0.05)。白藜蘆醇預(yù)處理各組的大鼠在TQ內(nèi)逗留的時(shí)間與溶劑對(duì)照組相比均無(wú)明顯差異(p>0.05)。
　　 (4)白藜蘆醇和Aβ1-42均未影響大鼠的視力和游泳速度
　　 在可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，各組到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間沒(méi)有任何差異(p>0.05)。另外，各組5天內(nèi)的游泳速度也沒(méi)有明

14、顯差異(p>0.05)。這表明各組的大鼠都沒(méi)有視力或運(yùn)動(dòng)的損傷。
　　 4、小結(jié)
　　 (1)雙側(cè)海馬注射Aβ1-42損傷了大鼠的學(xué)習(xí)記憶的活動(dòng)；
　　 (2)白藜蘆醇預(yù)處理抑制了Aβ1-42所致的大鼠學(xué)習(xí)記憶行為的改變；
　　 (3)白藜蘆醇預(yù)處理抑制Aβ1-42所致的大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的損傷未表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。
　　 第二部分：白藜蘆醇拮抗Aβ1-42所致大鼠海馬LTP壓抑的作用觀察

15、>　　 1、研究目的
　　 研究表明，海馬是除皮層外最重要的與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的腦區(qū)，在學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮非常重要的作用，而突觸傳遞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)是被公認(rèn)的學(xué)習(xí)記憶在細(xì)胞水平的模型。研究顯示，用合成的Aβ或天然的Aβ急性處理后，會(huì)損傷海馬的LTP。我們的實(shí)驗(yàn)將首先觀察，海馬注射Aβ1-42對(duì)由高頻刺激(HFS)誘導(dǎo)的海馬LTP的影響，在此基礎(chǔ)上觀察白藜蘆醇是否會(huì)拮抗Aβ1-42對(duì)LTP的壓抑作用。
　　 2、材料和方法

16、
　　 成年的雄性SD大鼠（體重220-240克），隨機(jī)分成4組，n=6。處理如下：
　　 1．溶劑對(duì)照組；
　　 2.Aβ1-42(0.22nM/lμl)組；
　　 3．Resveratrol（0.22nM/lμl）組；
　　 4.Resveratrol(0.22nM/lμl)+Aβ1-42(0.22nM/lμl)組。
　　 3、結(jié)果
　　 (1)海馬注射Aβ1-42明顯抑制了C

17、A1區(qū)由HFS誘導(dǎo)的LTP
　　 首先，我們確認(rèn)了海馬注射Aβ1-42明顯地抑制了在體HFS誘導(dǎo)的LTP。在海馬注射Aβ1-42(0.22nM)后，我們觀察了30分鐘內(nèi)的fEPSPs，及HFS后1小時(shí)內(nèi)的突觸反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)海馬注射Aβ1-42對(duì)基礎(chǔ)的突觸傳遞沒(méi)有明顯的影響。但是對(duì)LTP的誘導(dǎo)有明顯的壓抑作用（溶劑對(duì)照組：149.1±2.08%，Aβ組：121.5±2.73%，P＜0.05）。
　　 (2)白藜蘆醇單獨(dú)處理

18、未影響基礎(chǔ)的突觸傳遞及LTP
　　 為了檢測(cè)白藜蘆醇預(yù)處理是否會(huì)拮抗Aβ1-42所致的LTP損傷，我們首先觀察了白藜蘆醇單獨(dú)作用對(duì)基礎(chǔ)突觸傳遞及HFS誘導(dǎo)的LTP的影響。與溶劑對(duì)照組相比，海馬注射白藜蘆醇(0.22nM)后,30分鐘內(nèi)的基礎(chǔ)突觸傳遞，及HFS誘導(dǎo)的LTP均無(wú)明顯影響（白藜蘆醇組：141.1±2.44%，溶劑對(duì)照組：149.1±2.08%，p>0.05）。
　　 (3)白藜蘆醇預(yù)處理抑制了Aβ1-42所致的

19、LTP損傷
　　 隨后的實(shí)驗(yàn)我們觀察了白藜蘆醇與Aβ1-42共同作用對(duì)基礎(chǔ)突觸傳遞及HFS誘導(dǎo)的LTP的影響?；A(chǔ)的突觸傳遞沒(méi)有明顯改變。但在有白藜蘆醇預(yù)處理時(shí)，可以觀察到其對(duì)Aβ1-42所致的LTP損傷的明顯的抑制作用(Aβ組：121.5±2.73%，白藜蘆醇+Aβ組：137.3±3.42%，p<0.05)。
　　 (4)Aβ1-42和白藜蘆醇對(duì)雙脈沖易化(PPF)均未產(chǎn)生影響
　　 各處理組均可記到在體正常的

20、PPF，表明上述各種處理均沒(méi)有明顯影響Schaffer側(cè)支與CAI之間的突觸傳遞及突觸前事件。
　　 4、小結(jié)
　　 (1)海馬注射Aβ1-42顯著壓抑了CA1區(qū)HFS誘導(dǎo)的LTP;
　　 (2)白藜蘆醇預(yù)處理顯著拮抗了Aβ1-42所致的LTP壓抑。
　　 第三部分：白藜蘆醇對(duì)Aβ1-42所致大鼠海馬SIRT1含量和CREB磷酸化水平下降的作用觀察
　　 1、研究目的
　　 SIRT1對(duì)維

21、持正常的認(rèn)知功能及突觸的可塑性非常重要。SIRT1的激活增強(qiáng)了突觸的可塑性，而SIRT1功能的喪失，則會(huì)對(duì)突觸的可塑性造成損傷。并且，SIRTI的這種功能是通過(guò)腦內(nèi)特異的小RNA(micro-RNA)-miR-134對(duì)cAMP反應(yīng)結(jié)合蛋白(CREB)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。最新的報(bào)道也顯示，AD患者頂葉皮層中的SIRT1含量有明顯的下降(信使RNA含量下降了29%，蛋白含量下降了45%)，而且這種下降與Aβ在大腦皮層的聚集密切相關(guān)。另

22、外，亦有報(bào)道表明，在3xTg-AD小鼠（一種廣泛使用的AD模型小鼠）的海馬內(nèi)，pCREB比基礎(chǔ)水平減少了40%。本部分實(shí)驗(yàn)，我們將檢測(cè)大鼠海馬的SIRT1含量及CREB的磷酸化水平。首先觀察海馬注射Aβ1-42是否對(duì)SIRT1的表達(dá)和CREB的磷酸化產(chǎn)生影響，隨后觀察白藜蘆醇對(duì)Aβ1-42所致大鼠海馬SIRT1含量和CREB磷酸化水平下降的影響。
　　 2、材料和方法
　　 在完成第一部分觀察的大鼠，即結(jié)束水迷宮實(shí)驗(yàn)后，

23、經(jīng)麻醉后斷頭，其大腦被迅速移至冰臺(tái)，用冰冷的生理鹽水沖洗。將其海馬分離，并迅速放入液氮，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱，備用。用western blotting對(duì)目的蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。
　　 3、結(jié)果
　　 (1)白藜蘆醇對(duì)Aβ1-42所致的大鼠海馬SIRT1下降的影響
　　 與溶劑對(duì)照組相比，Aβ1-42處理組大鼠海馬的SIRT1蛋白水平顯著下降，這種下降可被白藜蘆醇預(yù)處理所逆轉(zhuǎn)。而白藜蘆醇單獨(dú)處理并未產(chǎn)生對(duì)海馬SIRT

24、1蛋白水平的影響。
　　 (2)白藜蘆醇對(duì)Aβ1-42所致的大鼠海馬CREB磷酸化下降的影響
　　 與溶劑對(duì)照組相比，Aβ1-42處理組大鼠海馬的CREB磷酸化水平顯著下降，這種下降可被白藜蘆醇預(yù)處理所逆轉(zhuǎn)。而白藜蘆醇單獨(dú)處理并沒(méi)有明顯影響海馬的CREB磷酸化水平。
　　 4、小結(jié)
　　 (1)白藜蘆醇抑制了Aβ1-42所致的大鼠海馬SIRT1的下降；
　　 (2)白藜蘆醇抑制了Aβ1-42所致的

25、大鼠海馬CREB磷酸化的下降。
　　 結(jié)論：
　　 1、Aβ1-42雙側(cè)海馬注射產(chǎn)生對(duì)學(xué)習(xí)、記憶的抑制，表現(xiàn)為水迷宮行為的改變及海馬LTP的壓抑；
　　 2、白藜蘆醇預(yù)處理發(fā)揮了對(duì)Aβ1-42毒性的保護(hù)作用，表現(xiàn)為白藜蘆醇取消了Aβ1-42引起的學(xué)習(xí)記憶行為（水迷宮）的改變，以及Aβ1-42引起的海馬LTP的壓抑：
　　 3、白藜蘆醇神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制可能與其對(duì)SIRT1與CREB的影響有關(guān)，表現(xiàn)為白藜蘆