骨骼肌損傷與修復(fù)過程中炎癥反應(yīng)與肌衛(wèi)星細(xì)胞再生關(guān)系的研究.pdf

1、急性骨骼肌損傷是人們在體育鍛煉和運(yùn)動訓(xùn)練中常見損傷之一，其發(fā)生比率較高。由于傷后炎癥反應(yīng)期長，愈合質(zhì)量差，易形成肌肉組織的血腫和修復(fù)性瘢痕。降低了肌肉收縮性能，使肌肉再損傷概率增加。嚴(yán)重地影響了人們?nèi)粘W(xué)習(xí)、工作和運(yùn)動，對運(yùn)動員的運(yùn)動能力、運(yùn)動壽命構(gòu)成了潛在威脅。因此，充分研究骨骼肌損傷機(jī)制，探討如何縮短傷后炎癥反應(yīng)期，加快肌再生速度，提高愈合質(zhì)量的康復(fù)措施一直都是運(yùn)動醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的一個重要課題。 骨骼肌急性損傷后，首先在損傷

2、的局部出現(xiàn)肌纖維結(jié)構(gòu)破壞、變性和壞死，之后炎癥細(xì)胞和致炎因子浸潤至損傷的部位。炎癥因子在損傷部位發(fā)揮著雙重作用，一方面吞噬壞死細(xì)胞和損傷的細(xì)胞碎片，另一方面通過分泌生長因子激活肌衛(wèi)星細(xì)胞（安靜時處于休眠狀態(tài)的，位于基底膜和肌膜之間），使其增殖形成新的肌管細(xì)胞進(jìn)而發(fā)育成肌纖維，修復(fù)損傷的肌纖維，完成肌肉的再生過程。在這里炎性細(xì)胞和致炎因子對肌再生起到了重要的作用。 骨骼肌損傷后的治愈分自然治愈和非自然因素干預(yù)治愈（藥物、生物學(xué)和非

3、生物學(xué)）。本研究建立了四種骨骼?。枘c肌和比目魚肌，快肌，慢?。p傷模型，在自然愈合的6小時、24小時、72小時取材，制備組織切片（HE染色），在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行了顯微結(jié)構(gòu)觀察。我們發(fā)現(xiàn)適宜的炎性細(xì)胞的對衛(wèi)星細(xì)胞的激活有一定的促進(jìn)作用，即炎性細(xì)胞在一定的范圍內(nèi)數(shù)量較多時，能夠促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的激活，但炎性細(xì)的數(shù)量超過一定的范圍，即肌肉損傷程度較重時，其激活作用受到抑制。 在四種骨骼肌損傷模型中，我們又重點選擇了鈍挫傷和跑臺誘導(dǎo)骨骼肌

4、損傷兩種模型在肌損傷后的修復(fù)期進(jìn)行藥物干預(yù)治療，即在損傷后的24小時后左側(cè)肢體傷處皮上定量噴灑云南白藥氣霧劑作為治療側(cè)；右側(cè)噴灑等量的生理鹽水作為非治療側(cè)，分別在給藥后24小時、2天、4天、7天、10天、14天各取4只大鼠后肢的治療側(cè)和非治療側(cè)腓腸肌和比目魚肌做切片進(jìn)行免疫組化標(biāo)記和HE染色。 在跑臺誘導(dǎo)骨骼肌損傷模型HE切片中，我們觀察到了損傷后的非治療組和治療組的炎性細(xì)胞和衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)量呈現(xiàn)出有規(guī)律性的變化。即損傷肌中的衛(wèi)星

5、細(xì)胞在傷后的24小時開始出現(xiàn)，但在炎性細(xì)胞出現(xiàn)高峰的第2天，其數(shù)量并不多；而在損傷肌的炎性細(xì)胞減至適宜數(shù)量的第7天卻大幅度升高；到第10天和14天炎性細(xì)胞數(shù)量過少時，衛(wèi)星細(xì)胞又開始下降。同時，我們還注意到，非治療組的炎癥細(xì)胞的數(shù)量顯然高于治療組（*P<0．01）。說明云南白藥對大鼠骨骼肌損傷后的炎癥細(xì)胞有一定的抑制作用。 在鈍挫傷的免疫組化切片中，我們看到這樣的現(xiàn)象，在損傷后治療初期（24小時），腓腸肌（快?。┬l(wèi)星細(xì)胞MyoD蛋

6、白（成肌細(xì)胞分化中的標(biāo)志性的分子）表達(dá)即為陽性，并在第2天和第4天蛋白持續(xù)表達(dá)。治療組的比目魚?。。㎝yoD蛋白在第2天表達(dá);而非治療組快肌在第4天才開始表達(dá)，非治療組慢肌MyoD蛋白表達(dá)全部呈陰性。結(jié)果顯示，治療組肌衛(wèi)星細(xì)胞MyoD蛋白表達(dá)強(qiáng)于非治療組，快肌強(qiáng)于慢肌。由此可見，云南白藥在骨骼肌損傷后的修復(fù)過程中的作用是通過抑制炎性細(xì)胞對傷后肌肉組織的破壞作用，縮短炎癥反應(yīng)進(jìn)程，對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化有一定的促進(jìn)作用，并且該作用

7、在快肌纖維上表現(xiàn)較為顯著，從而有利于損傷肌組織的修復(fù)。 為了更好的研究在骨骼肌損傷后的修復(fù)期炎性細(xì)胞對衛(wèi)星細(xì)胞的作用機(jī)理，我們選擇了在炎癥中發(fā)揮著重要的作用的白三烯（LTB4）這一致炎因子，試圖從細(xì)胞水平上探討骨骼肌損傷后LTB4與衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化的關(guān)系。 我們首先在原代衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中檢測到了致炎因子—LTB4受體BLT1和BLT2的表達(dá)。通過免疫熒光法、成肌細(xì)胞的熒光染色和計數(shù)等實驗方法研究了LTB4能否促

8、進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖和分化。研究結(jié)果表明，LTB4既能促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖又能促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化。LTB4促進(jìn)其增殖的作用呈濃度依賴的。其最佳濃度是60 nM，在此濃度下能顯著的促進(jìn)成肌細(xì)胞的增值。而LTB4促進(jìn)其分化作用是通過改變MyoD和M—cadherin的mRNA和蛋白的表達(dá)來完成的。在分別檢測BLT1和BLT2特異性抑制劑對成肌細(xì)胞增殖和分化的影響的實驗后，我們確定了致炎因子—LTB4通過BLT1介導(dǎo)的信號通路調(diào)控成肌細(xì)胞增殖和分化

9、。 綜上所述，本研究內(nèi)容主要是在對四種骨骼肌急性損傷模型研究的基礎(chǔ)上，分別觀察了大鼠骨骼肌損傷后的自然愈合和藥物（云南白藥）干預(yù)的修復(fù)期內(nèi)，炎癥細(xì)胞對肌衛(wèi)星細(xì)胞的影響作用及二者之間的關(guān)系。從分子水平上探討云南白藥促進(jìn)肌損傷修復(fù)的作用機(jī)制。重點圍繞骨骼肌的急性損傷后的炎癥反應(yīng)中炎癥因子—LTB4是否誘導(dǎo)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化展開深入研究。研究結(jié)果表明，LTB4在骨骼肌損傷后的修復(fù)過程中通過BLT1介導(dǎo)的信號通路促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的增