骨骼肌損傷修復(fù)過程中細(xì)胞去分化現(xiàn)象的初步研究.pdf

1、再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中,因干細(xì)胞具有多分化潛能和自我更新能力的生物學(xué)特征,其在修復(fù)再生過程的作用,受到越來越多的關(guān)注[1,2]。目前存在的問題是:獲取人類的胚胎干細(xì)胞不僅對胚胎組織是種損傷性的操作,更是受到倫理道德規(guī)范的束縛。成熟細(xì)胞去分化在哺乳動物再生中的作用一直存在爭議。在低等動物中,再生過程中細(xì)胞去分化是有機(jī)體長期進(jìn)化過程中獲得的一種保護(hù)性和適應(yīng)性現(xiàn)象,可以控制并且有限增殖。在低等動物(如蠑螈)機(jī)體損傷修復(fù)過程中,其體內(nèi)存在著強(qiáng)大的細(xì)胞去

2、分化能力,這一機(jī)體組織再生的理論已經(jīng)被廣泛接受和普遍認(rèn)可[3]；由于哺乳動物的組織器官在損傷修復(fù)的再生過程中,很大程度上受其局部環(huán)境(如炎癥細(xì)胞的作用)和機(jī)體整體環(huán)境(如免疫系統(tǒng)的破壞)因素的影響,一般認(rèn)為人類等哺乳動物的細(xì)胞去分化能力是相對低下的[4]。去分化在哺乳動物組織損傷修復(fù)中的作用已經(jīng)逐步受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。然而,在組織細(xì)胞損傷修復(fù)過程中,去分化現(xiàn)象觀察方法的建立,細(xì)胞去分化與凋亡之間的相互聯(lián)系等問題都有待進(jìn)一步深入研究。鑒

3、于此,我們建立大鼠的肌肉損傷模型,觀察肌肉損傷修復(fù)過程中組織形態(tài)學(xué)的變化,試圖從形態(tài)學(xué)角度觀察細(xì)胞去分化現(xiàn)象,并探討細(xì)胞去分化與細(xì)胞凋亡之間可能存在的某種聯(lián)系。
　　 是否存在某種途徑使得成體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為類干細(xì)胞狀態(tài)呢?Chen等人應(yīng)用人工合成的化學(xué)物質(zhì)“Reversine”(2-(4-morpholinoanilino)-6-cyclohexylaminopurine)成功誘導(dǎo)已分化成熟的細(xì)胞去分化返回到干細(xì)胞[5]。Rever

4、sine能使C2C12細(xì)胞去分化至“類干細(xì)胞”。這些“類干細(xì)胞”在不同的條件下,又分別能被誘導(dǎo)成為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。已經(jīng)有學(xué)者開始利用分子生物學(xué)等技術(shù)去探索Reversine誘導(dǎo)去分化發(fā)生的作用機(jī)理[6,7]。但關(guān)于Reversine在誘導(dǎo)去分化過程中對細(xì)胞增殖分化究竟是如何影響的,卻鮮見報(bào)道。為此我們以體外培養(yǎng)的C2C12小鼠成肌細(xì)胞為研究對象,分析Reversine對C2C12成肌細(xì)胞生長的影響,以明確Reversine在誘導(dǎo)去分

5、化過程中對成肌細(xì)胞狀態(tài)和功能的作用。
　　 [目的]
　　 1 觀察骨骼肌細(xì)胞損傷修復(fù)過程中骨骼肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；
　　 2 初步探討Reversine對小鼠C2C12成肌細(xì)胞生長的影響。
　　 [方法]
　　 1制作SD大鼠下肢腓腸肌肌肉損傷修復(fù)模型,術(shù)后27d在損傷處取材進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。
　　 1.1 通過透射電鏡對肌肉組織損傷修復(fù)細(xì)胞去分化現(xiàn)象進(jìn)行觀察；
　　 1.2 通過H

6、E染色和免疫熒光染色觀察骨骼肌細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)變化。
　　 2 C2C12小鼠成肌細(xì)胞系的體外培養(yǎng),分組處理。
　　 2.1 將C2C12小鼠成肌細(xì)胞分三組:A組:正常對照組,B組:1μM Reversine處理12h組,C組:1μM Reversine處理24h組。上述三組用Annexin-V/PI雙染法處理,并通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測三組C2C12細(xì)胞凋亡比例的差異；
　　 2.2 將C2C12小鼠成肌細(xì)胞分五組:

7、A組:正常對照組,B組:單獨(dú)1μM Reversine處理7d,C組:不加Reversine處理,單獨(dú)成骨誘導(dǎo)7d,D組:1μM Reversine誘導(dǎo)12h+單獨(dú)成骨誘導(dǎo)7d,E組:1μM Reversine誘導(dǎo)12h+1μM Reversine聯(lián)合成骨誘導(dǎo)7d。上述五組光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化,并通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(R.T-PCR)法檢測五組C2C12成肌細(xì)胞分化抑制因子(Id2),肌肉發(fā)生調(diào)節(jié)因子(Myogenin),生肌因子

8、后結(jié)蛋白(Desmin)mRNA的表達(dá)。
　　 [結(jié)果]
　　 1 電鏡觀察:損傷后的肌纖維溶解,并出現(xiàn)原始幼稚的細(xì)胞；
　　 2 HE染色觀察:與正常組織細(xì)胞相比,損傷處的組織細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞核大量聚集,且由多核細(xì)胞變成了單核細(xì)胞；
　　 3 免疫熒光染色:正常骨骼肌AIF未見表達(dá),損傷后的骨骼肌細(xì)胞中可見AIF明顯表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)；
　　 4 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果:與正常對照組相比,1μM Re

9、versine處理24h能引起C2C12細(xì)胞顯著的凋亡,1μM Reversine處理12h的C2C12細(xì)胞未見顯著的凋亡；
　　 5 Reversine處理后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果:與正常對照組相比,單獨(dú)Reversine處理組和1μM Reversine處理12h后再聯(lián)合成骨誘導(dǎo)組的細(xì)胞增殖明顯受到抑制,單獨(dú)誘導(dǎo)組和1μM Reversine處理12h后再單獨(dú)誘導(dǎo)組細(xì)胞逐漸增殖并融合；
　　 6 Reversine處理后

10、RT-PCR結(jié)果:與正常對照組相比,1μM Reversine 12h的培養(yǎng)條件下,Id2表達(dá)顯著增強(qiáng),且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明對Reversine耐受細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)；同時(shí),1μM Reversine 12h的培養(yǎng)條件下,Myogenin和Desmin兩者所表達(dá)的趨勢基本一致,表達(dá)顯著減弱,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明對Reversine耐受細(xì)胞的細(xì)胞成肌分化能力顯著減弱,細(xì)胞生長受到抑制。
　　 [結(jié)論]
　　 1 骨骼