一種新型長(zhǎng)效人胰島素類似物的研制.pdf

1、胰島素對(duì)于糖尿病,特別是胰島素依賴性糖尿病的治療至關(guān)重要。長(zhǎng)效胰島素的理想效果是通過(guò)盡可能少的胰島素注射次數(shù),在糖尿病患者體內(nèi)重建胰島素基礎(chǔ)分泌。國(guó)內(nèi)外運(yùn)用于臨床不久的兩種長(zhǎng)效人胰島素類似物:甘精胰島素(InsulinGlargine)和地特胰島素(InsulinDetemir)無(wú)明顯的代謝波峰和波谷,是真正意義上的基礎(chǔ)胰島素,但其有效控制血糖時(shí)間仍不能超過(guò)24h。頻繁地注射胰島素,給糖尿病患者帶來(lái)諸多的不便和痛苦,臨床上需要注射間隔時(shí)

2、間更長(zhǎng)的超長(zhǎng)效胰島素。以臨床需要為前提,前人對(duì)胰島素的結(jié)構(gòu)研究為基礎(chǔ),應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建含目的基因的重組質(zhì)粒,經(jīng)表達(dá)、酶切、純化和化學(xué)修飾,有希望篩選出有效控制血糖時(shí)間達(dá)到48h以上,不出現(xiàn)代謝的波峰和波谷,無(wú)需每日通過(guò)監(jiān)測(cè)病人血糖濃度來(lái)調(diào)整給藥量的一種新型長(zhǎng)效人胰島素類似物。
　　研究目的:構(gòu)建含短C肽AAK的人胰島素原類似物DesB30(HMPIDesB30HumanMini-proinsulinDesB30)的畢赤酵母表達(dá)

3、系統(tǒng),篩選高效分泌表達(dá)HMPIDesB30的重組畢赤酵母工程菌,獲得HMPIDesB30重組蛋白。建立HMPIDesB30的制備、純化及酶切(獲得人胰島素類似物HIDesB30,HumanInsulinDesB30)的中試生產(chǎn)工藝。利用14C脂肪酸、MPS(3-maleimidopropionicacidN-hydroxysuccinimideester,3-馬來(lái)酰亞胺丙酸羥基琥珀酰亞胺酯)及mPEG-SPA(methylpolyeth

4、yleneglycolsuccinimidylpropionate,甲基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酯)分別修飾HIDesB30,考察修飾后HIDesB30控制血糖的特性,以HIDesB30-14C脂肪酸(Detemir)為參照,篩選出有效控制血糖時(shí)間超過(guò)Detemir,并達(dá)到48h以上,不出現(xiàn)代謝的波峰和波谷的一種新型長(zhǎng)效人胰島素類似物。
　　研究方法:①HMPIDesB30在畢赤酵母中的高效表達(dá)1)利用兩種載體pPIC9K和pPI

5、CZalphaA篩選高表達(dá)菌株。HMPIDesB30/pPIC9K:首先利用pPIC9上的STE13識(shí)別位點(diǎn)編碼堿基之前的XhoI和多克隆位點(diǎn)中的NotI,將HMPIDesB30插入到pPIC9中,構(gòu)建重組質(zhì)粒HMPIDesB30/pPIC9,然后將HMPIDesB30亞克隆到pPIC9K上的SalI和SacI之間,構(gòu)建以α因子為分泌信號(hào)的重組質(zhì)粒HMPIDesB30/pPIC9K;HMPIDesB30/pPICZalphaA:利用pP

6、ICZalphaA上的STE13識(shí)別位點(diǎn)編碼堿基之前的XhoI和多克隆位點(diǎn)中的NotI,將HMPIDesB30插入到pPICZalphaA中,構(gòu)建以α因子為分泌信號(hào)的重組質(zhì)粒HMPIDesB30/pPICZalphaA。2)線性化HMPIDesB30/pPIC9K和HMPIDesB30/pPICZalphaA并電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115。3)利用含不同濃度G418或Zeocin的平板篩選獲得多拷貝重組工程菌HMPIDesB30/pPI

7、C9K/GS115或HMPIDesB30/pPICZalphaA/GS115。4)搖瓶表達(dá)HMPIDesB30并篩選高表達(dá)菌株。5)優(yōu)化發(fā)酵條件,發(fā)酵罐發(fā)酵。②HMPIDesB30的純化及酶切發(fā)酵液經(jīng)SIPI-40大孔吸附樹(shù)脂、SP柱純化后,用10-20mmol/LZn2+沉淀,再將沉淀溶于含10-20mmol/LEDTA的25mmol/LTris-HCl(pH9)中。按胰蛋白酶/HMPIDesB30質(zhì)量比1/500,4℃酶切過(guò)夜。③H

8、IDesB30的化學(xué)修飾用14C脂肪酸、MPS及mPEG-SPA分別修飾HIDesB30,并純化修飾后的產(chǎn)物。④幾種化學(xué)修飾HIDesB30的特性考察用幾種修飾后HIDesB30腹腔注射STZ(streptozotocin,鏈脲菌素)致糖尿病小鼠,考察藥效持續(xù)時(shí)間、藥效-劑量關(guān)系。對(duì)篩選出的藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)于Detemir的修飾產(chǎn)物作代謝特性研究。研究結(jié)果:①16.5％TricineSDS-PAGE、HPLC和質(zhì)譜分析出HMPIDesB3

9、0的分子量與理論分子量相符,經(jīng)高密度發(fā)酵,表達(dá)量可達(dá)1g/L。②HMPIDesB30的純化回收率可達(dá)60%,純度可達(dá)95%。單次胰蛋白酶酶切回收率可達(dá)90%。③經(jīng)14C脂肪酸修飾的HIDesB30最大修飾率為50%,其修飾產(chǎn)物的分子量與具有相同結(jié)構(gòu)的Detemir分子量一致,降血糖活性一致。經(jīng)MPS修飾的HIDesB30最大修飾率為80%,具有降血糖活性。在不同pH條件下mPEG-SPA修飾HIDesB30可獲得兩種修飾產(chǎn)物:HIDes

10、B30-PEG1(單分子PEG化HIDesB30)和HIDesB30-PEG2(2分子PEG化HIDesB30),最大修飾率為分別為60%和95%,均具有降血糖活性。④修飾后HIDesB30藥效持續(xù)時(shí)間與劑量有關(guān)。按藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短初步排序:HIDesB30-PEG1＞Detemir＞HIDesB30-PEG2＞HIDesB30-MPS。⑤HIDesB30-PEG1藥效持續(xù)時(shí)間超過(guò)48h,且無(wú)代謝的波峰與波谷。
　　結(jié)論:本研究實(shí)

11、現(xiàn)了含短C肽的人胰島素原類似物HMPIDesB30在畢赤酵母中的高效分泌表達(dá),表達(dá)量達(dá)1g/L,分泌表達(dá)的重組蛋白HMPIDesB30未出現(xiàn)糖基化,未形成二聚體和多聚體,并具有生物學(xué)活性。本研究確定了HMPIDesB30的發(fā)酵條件,克服傳統(tǒng)的酵母分泌表達(dá)產(chǎn)物超濾濃縮工藝無(wú)法除去大量色素的缺點(diǎn),用大孔吸附樹(shù)脂代替超濾,制定的純化工藝回收率高,終產(chǎn)品經(jīng)質(zhì)譜鑒定正確。此外,還建立了僅用胰蛋白酶單一酶切除去短C肽(形成HIDesB30)的方法和

12、條件,對(duì)今后工業(yè)化制備和研究重組胰島素具有重要意義。14C脂肪酸、MPS、mPEG-SPA分別修飾HIDesB30獲得的產(chǎn)物中,14C脂肪酸修飾HIDesB30所得產(chǎn)物的分子量與具有相同結(jié)構(gòu)的Detemir分子量一致,降血糖活性一致,但采用的表達(dá)系統(tǒng)、純化工藝及修飾方法與Detemir相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的制備方法完全不同,且本研究所采用修飾方法的修飾率高于Detemir文獻(xiàn)報(bào)道的方法。從幾種修飾產(chǎn)物中篩選出單分子PEG化HIDesB30(HI