新的肝細(xì)胞癌相關(guān)候選基因IDDO1的克隆和鑒定.pdf

1、為尋找與肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的新基因,該所于2000年運(yùn)用抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)技術(shù),構(gòu)建了HCC消減cDNA文庫(kù)并獲得了93個(gè)克隆,我們挑選其中2條表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequencetag,EST)P15、P65進(jìn)行研究.P15、P65的來(lái)源背景提示他們與HCC有著密切的關(guān)系,而目

2、前尚未發(fā)現(xiàn)P15、P65導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的直接證據(jù).為了驗(yàn)證這個(gè)推測(cè),為HCC尋找新的致病基因、診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn),該實(shí)驗(yàn)擬以P15、P65 EST序列為基礎(chǔ),1、使用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptase-PCR,RT-PCR)方法,對(duì)21例HCC標(biāo)本的肝硬化和HCC組織中P15和P65 mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),排除可能出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果;2、綜合運(yùn)用生物信息學(xué)(Bioinformatics)和cDNA末端快

3、速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術(shù)克隆P1 5、P65的全長(zhǎng)cDNA;3、將全長(zhǎng)cDNA的開(kāi)放讀碼框(open reading frame,ORF)克隆入真核表達(dá)載體pEGFP-C1,構(gòu)建重組表達(dá)載體,并將此表達(dá)載體轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞系HepG2和正常肝細(xì)胞系L02中,觀察P15、P65過(guò)表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響;4、克隆入原核表達(dá)載體,表達(dá)ORF編碼蛋白.為早期診斷、治療性試劑的研

4、制打下基礎(chǔ).結(jié)論1、P65是與HCC相關(guān)的差異表達(dá)基因的表達(dá)序列標(biāo)簽,而P15為假陽(yáng)性結(jié)果.2、生物信息學(xué)在正確選擇目標(biāo)EST、加速克隆新基因方面有其不可替代的作用.3、首次從HCC組織中克隆出HCC相關(guān)候選基因IDD01.4、成功構(gòu)建IDD01的真核報(bào)告表達(dá)載體pEGFP-ORF/P65.5、IDD01可加重肝癌細(xì)胞系HepG2的惡性表型,可增強(qiáng)正常肝細(xì)胞系L02的增殖能力,但不能使其發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化.6、成功構(gòu)建IDD01的原核表達(dá)載體