馬鈴薯候選寄主因子基因StTOM1-A、StTOM1-B和StTOM3的克隆和功能鑒定.pdf

1、馬鈴薯是世界第四大糧食作物。廣西馬鈴薯以冬種為主,這一時(shí)期正好填補(bǔ)國內(nèi)鮮薯市場(chǎng)的空白,具有非常大的發(fā)展?jié)摿?。但是病毒病?yán)重制約了廣西馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為了解廣西冬種馬鈴薯病毒病的發(fā)生情況及發(fā)展馬鈴薯抗病毒育種新技術(shù),本文開展了廣西冬種馬鈴薯病毒病調(diào)查及其病原病毒鑒定以及克隆和功能分析馬鈴薯候選病毒寄主因子基因的研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1、廣西冬種馬鈴薯病毒病害調(diào)查及病原病毒鑒定2010至2012年間對(duì)廣西冬種馬鈴薯主要產(chǎn)區(qū)的

2、病毒病發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查。田間疑似病毒病的發(fā)病率在2～10％之間。用病毒特異的RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè),從2010年所采樣品中檢測(cè)到馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和馬鈴薯S病毒(Potato virus S,PVS);從2011年所采樣品檢測(cè)到PVY、PVS和馬鈴薯A病毒(Potato virus A,PVA)。對(duì)2012年樣品,在用間接ELISA初篩的基礎(chǔ)上,用小RNA深度測(cè)序方法進(jìn)行病毒鑒定,再用RT-PCR進(jìn)

3、行驗(yàn)證,共檢測(cè)到PVY、PVS、PVA、馬鈴薯M病毒(Potato virus M,PVM)、馬鈴薯H病毒(Potato virus H,PVH)和馬鈴薯卷葉病毒(Potato leafroll virus,PLRV)等6種病毒和馬鈴薯紡錘體類病毒(Potato spindle tuber viroid,PSTVd)。對(duì)PVS多個(gè)分離物進(jìn)行序列分析,發(fā)現(xiàn)PVS有豐富的株系分化。
　　2、馬鈴薯候選病毒寄主因子基因StTOM1-A、

4、StTOM1-B和StTOM3的克隆和分析在馬鈴薯中克隆到擬南芥寄主因子基因AtTOM1和AtTOM3同源基因的cDNA和基因組DNA序列。其中,StTOM1-A基因的cDNA共有1227個(gè)核苷酸,包含一個(gè)849bp的編碼區(qū)、一個(gè)34bp的5′非編碼區(qū)和一個(gè)344bp的3′非編碼區(qū);StTOM1-B cDNA的全長為1287bp,編碼一個(gè)含有289個(gè)氨基酸的開放閱讀框,5′UTR為28bp,3′UTR為392bp;StTOM3基因的全長

5、cDNA共1254 bp,包含一個(gè)891bp的編碼區(qū),一個(gè)25bp的5′UTR,和一個(gè)338bp的3′UTR。獲得了StTOM1-A、StTOM1-B和StTOM3基因組的全長DNA,分別為6475bp、7627bp和6245bp。其中StTOM1-A基因組DNA共含有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子,外顯子大小介于44bp到415bp之間,內(nèi)含子介于76bp至1129bp之間;StTOM1-B全長基因組DNA含有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子,外

6、顯子最小為44bp,最大為466bp,內(nèi)含子最小為75bp,最大為2764bp;StTOM3全長基因組DNA共含有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子,其中外顯子大小介于41bp到403bp之間,內(nèi)含子介于77至1241bp之間。序列和進(jìn)化分析的結(jié)果表明,StTOM1-A、StTOM1-B和StTOM3與擬南芥、煙草、番茄中的寄主因子基因都有很高的同源性。疏水預(yù)測(cè)結(jié)果顯示StTOM1-A,StTOM1-B和StTOM3都是7次跨膜蛋白。South

7、ern雜交結(jié)果表明,StTOM1-A、StTOM1-B和StTOM3基因在馬鈴薯中都只有一個(gè)拷貝,時(shí)空表達(dá)結(jié)果顯示,這三個(gè)基因在馬鈴薯中可以穩(wěn)定表達(dá)。
　　3、抗病毒轉(zhuǎn)基因馬鈴薯新種質(zhì)的構(gòu)建分別構(gòu)建了StTOM1-B、StTOM3單干擾的植物雙元表達(dá)載體pBIStT1-Ri(±)和pBIStT3-Ri(±),以及StTOM1-B和StTOM3雙干擾的植物雙元表達(dá)載體pBIStT1-StT3-dRi(±),并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將其導(dǎo)

8、入到馬鈴薯中。PCR和Southern雜交結(jié)果顯示,獲得了轉(zhuǎn)StTOM1-B干擾的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株6棵,StTOM3干擾的轉(zhuǎn)基因植株4棵,轉(zhuǎn)StTOM1-B、StTOM3雙干擾的轉(zhuǎn)基因植株7棵。熒光定量PCR結(jié)果顯示,植物雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入后對(duì)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中StTOM1-B和StTOM3 mRNA的表達(dá)均有顯著的抑制作用。在轉(zhuǎn)pBIStT1-Ri(±)載體植株中StTOM1-B基因mRNA的表達(dá)水平僅為陰性對(duì)照的7.73%;在轉(zhuǎn)pBISt