草魚RIG-I和MDA5基因在干擾素誘導(dǎo)過程中的功能差異性研究.pdf

1、由模式識別受體（pathogen recognition receptors，PRRs）識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-asociated molecular patterns，PAMPs)而引起的天然免疫反應(yīng)是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防線。當(dāng)病毒進(jìn)入細(xì)胞后會被細(xì)胞內(nèi)的PRR——維甲酸誘導(dǎo)基因(retinoic acid-inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ)樣受體(RIG-Ⅰ like receptors，RLRs

2、)家族成員識別，而激活下游一系列信號，導(dǎo)致干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatoryfactor, IRF)3和IRF7的磷酸化激活和二聚體的形成，從而起始Ⅰ型干擾素(typeⅠinterferon，IFN-Ⅰ)的產(chǎn)生，最終誘導(dǎo)下游抗病毒效應(yīng)蛋白的表達(dá)和獲得性免疫反應(yīng)的激活。RLR家族的兩個重要的成員RIG-Ⅰ和黑色素瘤分化基因5(melanomadifferentiation-associated gene，MDA5)

3、具有廣泛的識別病毒核酸的功能，在抗病毒先天性免疫中起到非常重要的的作用。但有意思的是，RIG-Ⅰ同源基因在某些魚類[如大黃魚（Pseudosciaena crocea）]、雞（Gallus gallus）和中國樹鼩（Tupaia belangerichinensis）的基因組中沒有被鑒定到，而MDA5同源基因幾乎存在于所有被研究的脊椎動物中。這似乎暗示RIG-Ⅰ和MDA5的功能存在冗余性。目前的研究表明RIG-Ⅰ與MDA5在識別的核酸類

4、型上存在差異，對某些病毒的識別存在冗余，但人們對二者在Ⅰ型IFN誘導(dǎo)作用方面的差異性卻知之甚少。
　　草魚（grass carp，Ctenopharyngodon idella）是我國“四大家魚”之一，其養(yǎng)殖業(yè)長期以來受到各種疾病的困擾。由雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）病毒——草魚呼腸孤病毒（grass carp reovirus，GCRV）引起的草魚出血病嚴(yán)重影響著草魚種的成活率，因此GCRV和草魚

5、抗病毒免疫系統(tǒng)長期以來受到科研人員的廣泛關(guān)注。在研究過程中，草魚的RIG-Ⅰ和MDA5基因也被克隆和鑒定出來，并且被證明在抗GCRV感染中發(fā)揮著積極的作用。最近，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，草魚的IFN成員被充分地挖掘并鑒定出來。草魚Ⅰ型IFN包括四個成員，即IFN1、IFN2、IFN3和IFN4;而Ⅱ型IFN包含兩個成員，即IFN-γrel和IFNγ。人們對其他魚類各IFN的研究表明不同的IFN在功能上存在差異，但對各IFN的誘導(dǎo)通路的

6、認(rèn)識還比較模糊，草魚這6種IFN在細(xì)胞中的相對表達(dá)模式也還不清楚。因此我們想利用草魚腎細(xì)胞系（C.idella kidney，CIK）為研究對象，來探究草魚IFN的表達(dá)特征;重點用GCRV感染CIK細(xì)胞，來研究草魚RIG-Ⅰ和MDA5在IFN誘導(dǎo)方面的差異性。
　　我們利用實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)和雙熒光素酶報告試驗技術(shù)，發(fā)現(xiàn)未受到免疫刺激的CIK細(xì)胞中IFN1和I

7、FN3基因相對表達(dá)量較高，IFN-γrel和IFNγ基因表達(dá)量居中，IFN2和IFN4基因表達(dá)量較低;在GCRV或dsRNA類似物poly(I∶C)刺激細(xì)胞后，各IFN和代表性IFN刺激基因(IFN-stimulatedgenes，ISGs)的表達(dá)量在草魚MDA5過表達(dá)細(xì)胞中顯著高于RIG-Ⅰ過表達(dá)細(xì)胞;而且MDA5過表達(dá)比RIG-Ⅰ過表達(dá)更為強(qiáng)烈地促進(jìn)了各IFN啟動子活性。為了探究產(chǎn)生這種現(xiàn)象是否與IRF3和IRF7相關(guān)，我們又利用細(xì)

8、胞活力檢測、RT-qPCR和免疫印跡(immunoblotting，IB)技術(shù)證明了草魚IRF3和IRF7在GCRV感染后由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核遷移，并在細(xì)胞抗GCRV感染過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　隨后我們使用半定量(semi-qPCR)、雙熒光素酶報告試驗、IB技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞未受到免疫刺激時，RIG-Ⅰ和MDA5的過表達(dá)不會影響IRF3和IRF7的表達(dá);但在細(xì)胞受到免疫刺激時，RIG-Ⅰ和MDA5的過表達(dá)會在蛋白水平上顯著促進(jìn)I

9、RF3和IRF7的表達(dá)，并上調(diào)了它們的磷酸化水平。之后，我們使用免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)和IB技術(shù)深入研究了草魚RIG-Ⅰ和MDA5對IRF3和IRF7的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RIG-Ⅰ和MDA5過表達(dá)促進(jìn)了IRF3和IRF7的絲氨酸磷酸化;不同的是，MDA5同時也促進(jìn)了IRF7的蘇氨酸磷酸化，但RIG-Ⅰ卻抑制了IRF7的蘇氨酸磷酸化。這一現(xiàn)象導(dǎo)致的結(jié)果是:RIG-Ⅰ和MDA5過表達(dá)促進(jìn)了IRF3與IRF7的

10、異源二聚化，同時MDA5過表達(dá)也促進(jìn)了IRF7的同源二聚化，但RIG-Ⅰ過表達(dá)卻削弱了IRF7的同源二聚化作用。隨后為了探究草魚IRF3和IRF7二聚化對各IFN表達(dá)的影響，我們運(yùn)用了雙熒光素酶報告試驗。結(jié)果表明:IRF3的同源二聚化僅促進(jìn)了IFN1的啟動子活性，而IRF3和IRF7的異源二聚以及IRF7的同源二聚更為廣泛而強(qiáng)烈地促進(jìn)了Ⅰ型IFN的啟動子活性。由此說明了IRF7的同源二聚在Ⅰ型IFN啟動誘導(dǎo)中的重要作用，也闡明了RIG-

11、Ⅰ比MDA5對IFN表達(dá)的誘導(dǎo)作用弱的分子機(jī)制。最后，我們又利用RT-qPCR技術(shù)證明MDA5過表達(dá)誘導(dǎo)的白介素4（in terleukin4，IL-4）和IL-12p40基因表達(dá)量顯著高于RIG-Ⅰ過表達(dá)所誘導(dǎo)的表達(dá)量，從而為MDA5誘導(dǎo)了更高的Ⅱ型IFN基因表達(dá)提供了理論依據(jù)。
　　本研究表明草魚MDA5比RIG-Ⅰ誘導(dǎo)的IFN免疫反應(yīng)更為強(qiáng)烈，為RIG-Ⅰ和MDA5在功能上的冗余性提供了證據(jù)，同時也解釋了為什么RIG-Ⅰ同源