磷酸酶PHLPP對TLR及RIG-I觸發(fā)的Ⅰ型干擾素產生的選擇性調控作用及機制研究.pdf

1、天然免疫應答是由能夠識別病原相關分子模式(Pathogen-associated molecularpatterns，PAMPs)的受體所介導的，這些受體統(tǒng)稱為模式識別受體(Pattern recognitionreceptor，PRRs)。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類重要的模式識別受體，主要表達于巨噬細胞和樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)表面，特異性識別病原體中特定的分子

2、結構，激活其下游MyD88或TRIF依賴的信號通路，激活MAPK、NFκB或者IRF3信號，最終激活天然免疫細胞產生炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素，構成機體免疫系統(tǒng)抵御病原體入侵的第一道屏障。TLRs在各種生物體內高度保守，目前在小鼠中己發(fā)現(xiàn)12種TLRs。
　　 另一類受到廣泛關注的模式識別受體是維甲酸誘導的基因Ⅰ樣受體(retinoidacid-inducible geneⅠ(RIG-Ⅰ)-like receptors，RLRs)

3、，包括RIG-Ⅰ和MDA5(melanomadifferentiation-associated gene5)，它們都可以識別胞漿中的病毒RNA。常用于活化RIG-Ⅰ信號的RNA病毒有水泡口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)、仙臺病毒(Sendai virus，SeV)等。RIG-Ⅰ/MDA5識別相應病毒RNA后，通過招募接頭分子IPS-1(Interferon-beta promoter stimu

4、lator1)等激活下游信號，引起IRF-3以及NF-κB的核轉位，最終促進Ⅰ型干擾素和炎性細胞因子產生，激發(fā)機體抗病毒反應。
　　 TLR及RIG-Ⅰ不僅啟動天然免疫應答，控制炎癥反應的性質、強度和持續(xù)時間，還可以調節(jié)獲得性免疫應答的強度和類型，成為連接初始免疫應答和獲得性免疫應答的橋梁。所以，TLR及RIG-Ⅰ信號過度活化或活化不足會導致機體免疫功能異常和疾病的發(fā)生。許多其他信號通路參與對TLR及RIG-Ⅰ信號的嚴密調控，然

5、而到目前為止，對TLR和RIG-Ⅰ信號通路調控的分子機制還沒有完全研究清楚。因此，對TLR及RIG-Ⅰ信號轉導調控機制的深入研究具有重要的理論意義和應用價值。
　　 PHLPP(PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase)是一種具有PH(pleckstrin homology)結構域并且富含亮氨酸重復基序的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，它由N端的PH結構域、LRR(leucine-

6、rich repeat)結構域、PP2C(protein phosphatase2C)樣磷酸酶活性結構域以及C端的PDZ binding結構域組成，大鼠的同源物編碼1687個氨基酸。以前的研究發(fā)現(xiàn)在大鼠腦組織細胞中，PHLPP能通過其LRR區(qū)域直接與K-Ras相結合，負向調控K-Ras和MAPK信號途徑；PHLPP也能夠抑制ERK通路活化，參與大鼠腦組織長時間記憶的形成。PHLPP在多種腫瘤細胞中低表達，能夠通過PP2C樣磷酸酶活性區(qū)特

7、異性作用于Akt的473位絲氨酸，使其去磷酸化，從而抑制Akt依賴的腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡。PHLPP還可以依賴其PH區(qū)域使PKC去磷酸化，從而調控細胞內PKC的水平。這些研究提示PHLPP可通過其不同的功能域參與多條信號轉導通路的調控。
　　 蛋白磷酸酶在免疫應答中的調控作用受到越來越多的重視。已經報道數個磷酸酶，包括SHP-1(Src homology region2 domain-containing phosph

8、atase1)、SHP-2、SHIP-1(Src homology2 domain containing inositol-5'-phosphatase-1)和MKP-1(MAPKphosphatase-1)等，分別通過不同的機制調控TLR或RIG-Ⅰ觸發(fā)的天然免疫應答中炎性細胞因子和/或Ⅰ型干擾素的產生。那么PHLPP作為另一重要的參與細胞信號轉導調控的蛋白磷酸酶，是否參與天然免疫應答中TLR及RIG-Ⅰ信號轉導的調控尚不清楚。

9、>　　 本實驗分三部分內容對PHLPP是否參與天然免疫的調控以及可能的相關機制等問題進行了研究。
　　 一、PHLPP對TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)巨噬細胞產生Ⅰ型干擾素的選擇性促進作用
　　 我們研究發(fā)現(xiàn)PHLPP在小鼠腦組織、脾臟及淋巴結等組織和T細胞、B細胞、NK細胞、DC、腹腔巨噬細胞以及RAW264.7細胞株等免疫細胞中廣泛表達。并且TLR配體LPS、poly(I∶C)刺激以及RIG-Ⅰ配體VSV感染可以誘導巨噬細

10、胞表達PHLPP蛋白增加。
　　 結果顯示PHLPP促進TLR配體誘導的TRIF依賴的以及RIG-Ⅰ配體誘導的Ⅰ型干擾素的產生，而對其誘導的炎性細胞因子產生以及MyD88依賴的細胞因子產生無明顯影響。
　　 二、PHLPP選擇性調控TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)Ⅰ型干擾素產生的分子機制研究
　　 為明確PHLPP各個結構域的功能，我們根據PHLPP的分子結構構建了不同的PHLPP缺失突變載體。瞬時轉染這些缺失突變載體后，

11、檢測對TRIF活化IFN-β報告基因的活性的影響。結果發(fā)現(xiàn)缺失LRR或者PP2C結構域的PHLPP突變體不能促進TRIF活化IFN-β報告基因的活性，而缺失PH或者PDZ結構域的PHLPP突變體仍然能夠顯著促進TRIF活化IFN-β報告基因的活性；單一表達PP2C結構域的PHLPP突變體不能促進TRIF活化IFN-β報告基因的活性，而表達LRR和PP2C結構域的PHLPP突變體能夠顯著促進TRIF活化IFN-β報告基因的活性。同時，我們

12、發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞中瞬時轉染缺失LRR或者PP2C結構域的PHLPP突變體不能促進poly(I：C)誘導的Ⅰ型干擾素的產生。由此認為，PHLPP正向調控TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)的Ⅰ型干擾素的產生是依賴于其LRR結構域和磷酸酶活性結構域PP2C。我們觀察了PHLPP對TLR及RIG-Ⅰ信號活化的MAPKs、NF-mκB的影響。
　　 結果表明巨噬細胞中PHLPP在細胞核內通過其LRR結構域與活化的IRF3 C端結合，通過其PP2C磷酸酶

13、活性區(qū)使IRF3 S332去磷酸化，從而抑制S332磷酸化依賴的IRF3泛素化和降解，維持IRF3蛋白的穩(wěn)定，促進Ⅰ型干擾素的產生。
　　 三、PHLPP通過促進Ⅰ型干擾素產生而參與抵抗病毒感染的作用
　　 為探討PHLPP正向調控TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)的Ⅰ型干擾素的產生這一功能在感染性疾病，特別是病毒感染性疾病中的作用，我們首先觀察了PHLPP對VSV復制的影響。實驗發(fā)現(xiàn)PHLPP基因敲除小鼠的腹腔巨噬細胞在VSV感染

14、后，培養(yǎng)上清中VSV病毒滴度(TCID50)顯著增加，用培養(yǎng)上清處理的HEK293細胞迅速出現(xiàn)細胞變圓等病毒感染性病變及細胞死亡；而在巨噬細胞培養(yǎng)過程中中加入重組小鼠IFN-β，可以明顯降低VSV病毒滴度，減少HEK293細胞死亡率。上述結果表明PHLPP通過促進Ⅰ型干擾素的產生而抑制了VSV的復制。
　　 進一步我們取小鼠體內感染VSV24-48小時之后的臟器檢測病毒感染情況，發(fā)現(xiàn)PHLPP基因敲除小鼠的肝臟和脾臟組織中VSV

15、的復制和病毒滴度(TCID50)較對照小鼠顯著增加，表明PHLPP在體內參與了抵抗VSV感染的效應。
　　 本部分研究表明PHLPP通過促進體內TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)的Ⅰ型干擾素的產生，抑制VSV的復制，提高小鼠對VSV體內感染的抵抗能力，提示其在抵御病毒感染性疾病中發(fā)揮著重要的作用。
　　 綜合以上三部分研究結果，我們發(fā)現(xiàn)磷酸酶PHLPP參與了巨噬細胞中TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)的Ⅰ型干擾素產生的正向調控；證明了PHLPP