應用RNAi阻斷AhR介導的TCDD免疫毒理作用的初步研究.pdf

1、2,3,7,8-四氯二苯-對-二噁英(2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)是環(huán)境污染物多氯聯(lián)苯類化合物中毒性最強的一種。研究發(fā)現(xiàn)，TCDD有強烈的致癌、致畸、致病的毒性作用，對人體的免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)等產(chǎn)生嚴重損傷，并危害肝臟、眼睛、皮膚等多種器官的功能。因此研究其作用機制具有重要的理論意義和臨床價值。 免疫系統(tǒng)是對TCDD最敏感的靶系統(tǒng)之一，TCDD對機體的細

2、胞免疫、體液免疫和抵抗力都有顯著的抑制效應。而隱藏在這一系列功能改變下面的分子水平機制研究也逐漸得到深入。TCDD的芳香烴受體(arylhydrocarbonreceptor，AhR)介導途徑、TCDD對多種激酶信號轉導途徑的干預、對細胞內Ca2+代謝、自由基代謝的影響、TCDD與激素受體的相互作用是近年來研究的幾個主要方向。其中，以TCDD的AhR介導途徑得到最多的關注。 AhR被認為是TCDD在細胞內的重要受體，在TCDD免

3、疫毒性介導途徑中起到重要作用，其可能機制是，AhR與TCDD結合后被激活，隨即進入細胞核結合AhR核轉位因子，然后通過識別并結合效應基因的啟動子、增強子等基因調控元件，增強或抑制效應基因的表達，從而直接或間接影響淋巴細胞的功能。 我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)：①TCDD對B淋巴細胞的功能存在顯著的抑制效應；②B淋巴細胞存在AhR；③AhR是TCDD抑制B淋巴細胞功能的重要介導途徑；④可能有非AhR依賴的信號轉導途徑存在。同時也有其他實驗

4、室研究資料表明，AhR并非是TCDD毒理效應的唯一介導途徑。 綜合以上研究資料可以看出，如采用一定研究手段抑制TCDD毒理作用中AhR基因的表達，可具有以下兩方面的意義，1)觀察抑制AhR表達是否阻斷TCDD免疫毒性作用，為TCDD中毒癥狀的治療提供靶點及理論依據(jù)；2)觀察AhR表達的下降程度與TCDD免疫毒性的減弱程度之間的關系，明確AhR在TCDD免疫毒性作用介導過程中的地位，進一步揭示TCDD的毒性作用機制。 近年

5、在分子生物學研究領域引起廣泛重視的RNA干擾(RNAinterference，RNAi)屬于轉錄后基因沉默機制中的一類。該現(xiàn)象的主要原理是，小分子干擾RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)能夠在細胞內結合包括RNA酶在內的多種配基形成RNA誘導沉默復合體，該復合體能特異地識別并降解與siRNA同源的mRNA序列，從而達到基因沉默的目的。 RNAi已被開發(fā)為一項特異性抑制基因表達的得力工具，并隨著hH1、h

6、U6、mU6等具有siRNA特異性的啟動子被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，對siRNA表達的人為調控成為可能，也使RNAi技術具備了長效沉默基因表達的能力。尤其是與轉基因技術結合以后，RNAi技術具有了巨大的潛在臨床應用價值。 研究表明，TCDD在人體或動物體內的滯留時間很長，其毒性作用也一直持續(xù)存在。Baccarelli等對20年前意外事故中暴露于TCDD的人群進行跟蹤調查發(fā)現(xiàn)，暴露者血液中仍可檢測出高含量的TCDD，并且其濃度與血漿中免疫球蛋白

7、和補體水平的降低成正比。有鑒于此，構建有效表達AhRsiRNA的病毒或相關載體，并研究其對TCDD免疫毒性效應的阻斷能力，將為TCDD隉性中毒的基因治療提供手段和理論基礎。 基于以上幾個方面的認識，本研究擬在已有的工作基礎上，達成三個目標：①采用暫時性RNAi技術抑制CH12.LX細胞中AhR基因的表達，觀察AhR基因表達的沉默是否阻斷了TCDD的免疫毒性作用，以進一步明確AhR在TCDD效應機制中的地位，及為TCDD中毒的治療

8、提供靶點及理論依據(jù)；②篩選出能進入B淋巴細胞株的載體，為長效RNAi研究奠定基礎，并為TCDD慢性中毒的基因治療提供理論依據(jù)和有效手段；③對RNAi技術在應用方面的不足之處進行探索和完善。 本研究的主要實驗結果及結論：1.TCDD對CH12.LX細胞的免疫毒性效應.2.AhR基因表達的暫時性抑制及其對TCDD免疫毒性的阻斷效應. 3.AhR基因表達長效性抑制的初步探索前期研究發(fā)現(xiàn)質粒轉染試劑對CH12.LX細胞的轉染效率極低，因