卵巢癌中IgG表達(dá)的臨床意義及應(yīng)用RNAi技術(shù)阻斷其表達(dá)的研究.pdf

1、第一部分：卵巢癌中IgG表達(dá)的臨床意義 [目的] 目前諸多實(shí)驗(yàn)結(jié)果均發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在有IL-6，IL-10，GM-CSF等細(xì)胞因子的異源性表達(dá)[1]，那么免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)在惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)的出現(xiàn)就并不足以為奇。邱曉彥等研究表明[2，3，4]通過(guò)免疫組化、WesternBlot等實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌、大腸癌、肝癌、卵巢癌等多種上皮性惡性腫瘤細(xì)胞的胞漿中存在與免疫球蛋白(Ig)抗原

2、性相同、分子結(jié)構(gòu)極為相似的蛋白分子，最初命名為Ig樣蛋白(Ig-like-protein)，而且進(jìn)一步通過(guò)N端氨基酸測(cè)序明確了Ig樣蛋白即為傳統(tǒng)意義上的免疫球蛋白G；通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reversetranscription-polymerasechainreation，RT-PCR)和NorthernBlot，發(fā)現(xiàn)在人上皮來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在免疫球蛋白重鏈基因可變區(qū)基因(immunoglobulinheavychainge

3、nevariableregion，IgHV)重排結(jié)構(gòu)，從而提出了“人上皮來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞中存在免疫球蛋白的表達(dá)，，這一嶄新概念。然而對(duì)其定量表達(dá)與腫瘤分化、臨床病理類型之間的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究的目的就是分析卵巢癌組織中IgG表達(dá)與其臨床病理類型、細(xì)胞分化之間的關(guān)系，探討其臨床意義。 [方法] 1.將收集到的卵巢瘤標(biāo)本(惡性30例，良性17例)制備成單細(xì)胞懸液； 2.應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液去除組織中浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞

4、，提純卵巢腫瘤細(xì)胞； 3.調(diào)整細(xì)胞濃度后加入細(xì)胞裂解液； 4.采用雙抗體夾心ELISA法來(lái)檢測(cè)裂解產(chǎn)物中IgG的含量。 [結(jié)果] 1.卵巢癌腫瘤細(xì)胞中能夠檢測(cè)到IgG的表達(dá)，而在卵巢良性腫瘤中檢測(cè)不到IgG的表達(dá)； 2.與非上皮來(lái)源的卵巢惡性腫瘤相比，上皮來(lái)源的卵巢惡性腫瘤其IgG的表達(dá)量明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)； 3.與臨床分期早的卵巢癌相比，臨床分期晚的卵巢癌其IgG的

5、表達(dá)量無(wú)明顯升高，不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)； 4.與高、中分化程度的卵巢癌相比，低分化的卵巢癌其IgG的表達(dá)量明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 [結(jié)論] 1.惡性卵巢腫瘤中IgG表達(dá)水平明顯升高，其表達(dá)量與卵巢癌病理類型相關(guān)，即上皮來(lái)源的卵巢癌中其IgG表達(dá)顯著高于非上皮來(lái)源卵巢癌； 2.上皮來(lái)源的卵巢癌中IgG表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞的分化程度呈明顯的負(fù)相關(guān)，即IgG表達(dá)量隨分化程度的降低而升高

6、。 第二部分：運(yùn)用RNAi技術(shù)抑制IgG基因表達(dá)的研究 [目的] RNAi技術(shù)是近年來(lái)新興的基因沉默技術(shù)，它能特異性抑制內(nèi)源性或外源性靶基因。這項(xiàng)新技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用尤其突出，不僅可應(yīng)用于基礎(chǔ)研究，還有望成為攻克腫瘤、艾滋病等新的治療方法[5]。尤其siRNA在基因治療方面將有著更為廣闊的前景。邱曉彥等不僅提出了“人上皮來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞中存在免疫球蛋白的表達(dá)”這一嶄新概念，而且進(jìn)一步的研究表明[6]通過(guò)反義技

7、術(shù)干擾其表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞來(lái)源的IgG具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的生物學(xué)活性。本研究旨在運(yùn)用RNAi技術(shù)抑制卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中IgHV基因的表達(dá)，并觀察對(duì)其細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。探討RNAi新技術(shù)在抗腫瘤基因治療方面的應(yīng)用前景以及封閉腫瘤細(xì)胞中IgHV基因作為惡性腫瘤治療靶點(diǎn)的可能性。 [方法] 1.根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)并化學(xué)合成siRNA序列，其中兩對(duì)特異性的siRNA序列，分別為siRNAl、siRNA

8、2；陰性對(duì)照siRNA序列為siRNA3；另外合成FAM標(biāo)記的siRNA； 2.復(fù)蘇、培養(yǎng)培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期； 3.將FAM標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染入卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中，觀察轉(zhuǎn)染效果； 4.將特異性的siRNAl、siRNA2及陰性對(duì)照siRNA3通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑導(dǎo)入到卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中，空白對(duì)照組為未做任何siRNA的轉(zhuǎn)染； 5.分別應(yīng)用RT-PCR和Western-Blot來(lái)檢

9、測(cè)4個(gè)組轉(zhuǎn)染后48h后IgHV重排基因mRNA和IgG蛋白的表達(dá)；同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)觀察轉(zhuǎn)染48h后卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞凋亡的情況。 [結(jié)果] 1.RT-PCR結(jié)果顯示特異性siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3后，IgHV重排基因mRNA的表達(dá)明顯降低； 2.Western-Blot結(jié)果表明特異性siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3后，IgG蛋白表達(dá)降低； 3.流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)應(yīng)用RNAi干擾IgHV表達(dá)后，誘導(dǎo)了卵巢癌細(xì)胞