Jak2的缺失通過(guò)減弱Raf-1-Sp-1信號(hào)通路并Enosey STAT活性損傷內(nèi)皮功能.pdf

1、目的：旨在探討Jak2在保持血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)中的作用及其缺陷對(duì)內(nèi)皮功能的影響。由于Jak2缺陷會(huì)導(dǎo)致胚胎期死亡，目前對(duì)Jak2在保持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)作用的研究多采用Jak2抑制劑，然而Jak2在出生后內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)中的確切機(jī)制卻并不明了。在本研究中，我們用了tamoxifen（他莫昔芬）誘導(dǎo)的成年Jak2敲除小鼠模型。利用這種基因敲除模型，我們檢測(cè)了胸主動(dòng)脈收縮舒張能力。利用基質(zhì)膠栓比較了Jak2基因敲除對(duì)內(nèi)皮血管生成的影響。之外，我們還創(chuàng)建了小鼠后

2、肢缺血模型以探索Jak2在缺血后血管再生、血流恢復(fù)中的作用。鑒于Jak2在內(nèi)皮功能以及血管再生中所起的作用，我們對(duì)相應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行了探索，以期對(duì)Jak2在內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)中所起的作用有更深的理解，而且對(duì)以Jak2為基礎(chǔ)的臨床治療及研究提供更多的方法和手段。
　　 方法：⑴Jak2基因敲除小鼠模型:Jak2fl/fl與Cre-ERT2轉(zhuǎn)基因小鼠雜交生成Cre+-Jak2fl/fl小鼠。在本研究中，只采用了雄性小鼠。在8周時(shí)，對(duì)Cre+-Ja

3、k2fl/fl小鼠連續(xù)5天皮下注射他莫昔芬（25mg/kg體重）誘導(dǎo)Jak2基因敲除。⑵在Jak2基因敲除及對(duì)照小鼠中，我們檢測(cè)了胸主動(dòng)脈的收縮、舒張功能;利用基質(zhì)膠栓方法測(cè)定了血管生成情況，通過(guò)測(cè)定基質(zhì)膠栓中血紅蛋白含量及CD31染色比較Jak2敲除小鼠及對(duì)照鼠血管生成的區(qū)別;除此之外，我們還對(duì)后肢血管結(jié)扎的Jak2敲除小鼠及對(duì)照小鼠血流恢復(fù)情況進(jìn)行了比較，收集缺血的下肢組織進(jìn)行了CD31免疫熒光染色。⑶從Jak2基因敲除及對(duì)照小鼠主

4、動(dòng)脈提取蛋白，定量后進(jìn)行Western Blot探測(cè)STAT家族蛋白，eNOS，p-eNOS，MEK1，p-MEK1，AKT, p-AKT, ERK1/2，p-ERK1/2，p38及p-p38的表達(dá)水平。采用免疫共沉淀的方法，在主動(dòng)脈蛋白裂解液中檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Sp-1的表達(dá)水平。⑷培養(yǎng)豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，用TNFa及PD89059(MEK1抑制劑)或者AZD1480(Jak2抑制劑)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理后測(cè)定Raf-1，pRaf-1，MEK1，p

5、MEK1， Sp-1，pSp-1表達(dá)水平的變化。并采用電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)在經(jīng)過(guò)以上處理的細(xì)胞中檢測(cè)Sp-1對(duì)e NOS啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合力的變化。
　　 結(jié)果：①Jak2功能缺失損傷了內(nèi)皮依賴的血管舒張:與對(duì)照小鼠相比，Jak2基因敲除小鼠胸主動(dòng)脈對(duì)有賴于內(nèi)皮的血管舒張劑的反應(yīng)減弱。②Jak2的缺陷損傷了血管再生的能力:基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)照小鼠的血紅蛋白含量是Jak2基因敲除小鼠的3.3倍(0.99±0.2μg/mg gel

6、vs.0.23±0.1μg/mg gel，P＜0.001)。免疫熒光染色顯示在Jak2缺陷小鼠中CD31陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)以及管狀結(jié)構(gòu)相比對(duì)照小鼠都要少。③Jak2缺失減慢了后肢缺血?jiǎng)?chuàng)傷后新生血管的生成及血流的恢復(fù):后肢缺血手術(shù)后，Jak2基因敲除小鼠的血流恢復(fù)比對(duì)照小鼠明顯慢。對(duì)缺血后下肢肌肉組織進(jìn)行免疫熒光染色顯示，CD31陽(yáng)性及α-actin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在Jak2缺陷小鼠明顯低于對(duì)照小鼠。④Jak2缺失降低了eNOS，AKT的表達(dá):We

7、stern Blot結(jié)果表明在Jak2缺陷的小鼠主動(dòng)脈中，eNOS，p-eNOS及AKT, p-AKT表達(dá)量明顯低于對(duì)照小鼠。⑤Jak2缺失影響了Raf1/MEK1信號(hào)傳導(dǎo)通路并減弱了Sp-1的活性:Western Blot及免疫共沉淀表明Jak2基因敲除小鼠中Raf1/MEK1信號(hào)通路中的蛋白表達(dá)減少。EMSA顯示Sp-1的活性在Jak2基因敲除小鼠中是降低的。⑥Jak2缺陷導(dǎo)致了STAT信號(hào)通路的改變:Jak2基因敲除小鼠主動(dòng)脈ST

8、AT3，STAT5及STAT6表達(dá)水平下降，協(xié)同了RAF1/MEK1對(duì)血管生成的負(fù)面影響。
　　 結(jié)論：Jak2基因的缺失導(dǎo)致了血管內(nèi)皮的功能不良，表現(xiàn)在內(nèi)皮依賴的血管舒張功能的受損，血管再生能力的下降以及后肢缺血損傷后血流恢復(fù)的減慢。Jak2缺失導(dǎo)致的內(nèi)皮功能受損及血管再生能力的下降是由于Raf1/MEK1/Sp-1/eNOS這條信號(hào)傳導(dǎo)通路受到了影響。此外，STAT3，STAT5和STAT6的水平在Jak2基因敲除小鼠主動(dòng)脈