抑制JAK-STAT信號(hào)通路對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠肝損傷的保護(hù)作用.pdf

1、重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一種嚴(yán)重危及生命的全身性疾病，起病急，病情重，并發(fā)癥多，病死率達(dá)20％-30％，該病早期即可累及肺、腎、肝等胰外臟器，導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征（multi-organ dysfunction syndrome，MODS），競(jìng)而發(fā)展為多臟器的功能衰竭（multi-organ failure，MOF）。盡管肝臟有較強(qiáng)的代償和再生能力，肝功能異常仍會(huì)時(shí)常出現(xiàn)，而且是

2、SAP進(jìn)展過程中的一個(gè)致命的并發(fā)癥，提示該病預(yù)后不良。由于胰腺血液在回流心臟前需經(jīng)過肝的代謝和處理，而肝巨噬細(xì)胞占整個(gè)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的80％～90％，是體內(nèi)最大的固定巨噬細(xì)胞群，因此，肝是SAP常累及的胰外器官之一。而且，肝功能損害已被認(rèn)為是判斷SAP嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，已作為獨(dú)立的指標(biāo)合并進(jìn)了預(yù)測(cè)AP嚴(yán)重程度的Ranson評(píng)分和急性生理慢性健康評(píng)估Ⅱ（Acute Physiological Chronic Health Evalua

3、tion Ⅱ，APACHE Ⅱ）系統(tǒng)，對(duì)預(yù)測(cè)SAP臨床預(yù)后尤為重要。關(guān)SAP出現(xiàn)臟器并發(fā)癥的機(jī)制，目前還不甚清楚。1988年，Rindermecht提出了急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制的新見解，認(rèn)為胰腺在胰酶異常激活所造成的損害過程中，激活了單核巨噬細(xì)胞，進(jìn)而造成促炎細(xì)胞因子和活性氧簇的釋放，它們又可進(jìn)一步導(dǎo)致粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的過度激活而釋放大量的炎癥介質(zhì)，形成所謂的“第二次打擊”，導(dǎo)致炎癥從胰腺局部迅速擴(kuò)散到全身，發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征（syst

4、emic inflammatory response syndrome，SIRS），MODS以致死亡。 早在1984年就有報(bào)道，80％AP患者有肝功能損害，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平升高，并且LDH水平與AP的嚴(yán)重程度呈正相

5、關(guān)。實(shí)驗(yàn)研究表明，AP時(shí)可見明顯的肝細(xì)胞病理改變。光鏡下，可見肝細(xì)胞變性、散在的液化性壞死灶，Kupffer細(xì)胞腫脹。電鏡下，可見糖原顆粒減少；脂質(zhì)小滴大小和數(shù)目增加；線粒體腫脹，其基質(zhì)和嵴變性；自噬體和溶酶體增多；肝竇內(nèi)皮損害伴吞噬細(xì)胞活性增加。并出現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)酸中毒、鈉離子超載及肝細(xì)胞生物能的耗竭等生化改變以及肝細(xì)胞凋亡顯著增多。目前，細(xì)胞因子在SAP的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用已越來越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，干預(yù)或拮抗細(xì)胞因子的治

6、療將成為SAP具有發(fā)展前景的治療方法。 Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（janus kinase/signal transducer and activator of-transcription，JAK/STAT）信號(hào)通路是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，它廣泛參與細(xì)胞增殖分化、凋亡、炎癥、腫瘤等多種生理、病理生理過程，對(duì)機(jī)體有重要影響。它把細(xì)胞膜上感受的信號(hào)直接傳遞到核內(nèi)，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，環(huán)節(jié)少而簡(jiǎn)潔。JAK/STAT信號(hào)通

7、路由JAKs蛋白家族（JAK1、JAK2、JAK3、TYK2）和STATs蛋白家族（STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6）組成。JAK是STAT的上游共有激酶。細(xì)胞外可溶性信號(hào)分子（細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等）識(shí)別并與細(xì)胞膜上的特異受體結(jié)合后誘導(dǎo)受體聚化構(gòu)成二聚體或三聚體，在胞漿內(nèi)形成高親和性的JAKs結(jié)合位點(diǎn)，JAKs與受體胞漿區(qū)域的JAKs結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后發(fā)生自身或與受體交叉酪氨酸磷酸化而活

8、化，活化的JAKs進(jìn)一步募集細(xì)胞漿內(nèi)相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)和STATs，導(dǎo)致STATs二聚化、活化、核移位，結(jié)合到相應(yīng)基因的啟動(dòng)子上，啟動(dòng)基因表達(dá)，發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。AG490（tyrphosin AG490）是一種人工合成的苯亞甲基丙二腈的脂類衍生物，結(jié)構(gòu)類似于酪氨酸，可以和受體酪氨酸激酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位置，特異性阻滯各種細(xì)胞因子引起的JA K2和下游分子STA T 3的的磷酸化激活，從而阻斷下游激酶STAT的活化進(jìn)而抑制細(xì)胞因子的生理和病理效應(yīng)

9、。 基于此，本研究將通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)建立SAP模型，利用Western blot、免疫組化等技術(shù)研究實(shí)驗(yàn)性SAP肝組織中JAK2的表達(dá)情況，并通過JAK/STAT信號(hào)通路抑制劑AG490進(jìn)行干預(yù)研究，通過觀察SAP大鼠肝組織JAK2蛋白的表達(dá)情況及其與肝功能和病理形態(tài)損傷之間的關(guān)系，探討重癥急性胰腺炎時(shí)JAK/STAT通路活化在肝損傷中的作用。以從分子水平闡明SAP肝損傷的發(fā)病機(jī)制，為SAP肝損傷臨床治療提供一個(gè)新的思路?！　?

10、 目的:　　 1、建立SAP大鼠模型。觀察SAP時(shí)出現(xiàn)的肝功能和胰腺、肝臟損傷組織學(xué)方面的改變，同時(shí)觀察JAK2蛋白在正常對(duì)照組和SAP造模組肝組織中的表達(dá)情況；了解JAK/STAT信號(hào)通路在重癥急性胰腺炎肝損傷中的作用?！　?2、觀察JAK/STAT信號(hào)通路抑制劑AG490對(duì)SAP時(shí)肝損傷的治療作用，以及對(duì)肝臟JAK2蛋白表達(dá)的影響。對(duì)SAP疾病進(jìn)程中胰外器官損傷發(fā)生率高、病死率高的原因進(jìn)行初步探討，為臨床最終達(dá)到提

11、高SAP療效、減少SAP的并發(fā)癥及降低其病死率提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。　　 材料和方法:　　 1、SD大鼠56只，隨機(jī)分3組：正常對(duì)照組（NC組，n=8）；SAP造模組（SAP組，n=24）；SAP造模+AG490組（SAP-AG組，n=24）。每組再分為6、12、18h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各8只大鼠?！　?2、采用4％?；悄懰徕c逆行注入胰膽管誘發(fā)SAP模型。SAP組于造模后2h腹腔注射生理鹽水1ml，12h后重復(fù)

12、1次；SAP-AG組于造模前半小時(shí)腹腔注射AG490。NC組模擬胰膽管穿刺操作，但不注射藥物?！　?3、NC組、SAP-S組與SAP-AG490組于6、12、18h心臟穿刺抽血，測(cè)血清淀粉酶（AMY）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平，并測(cè)定腹水量，留取標(biāo)本在光鏡下觀察胰腺及肝組織病理學(xué)改變，采用免疫組化方法檢測(cè)JAK2蛋白在肝臟中的表達(dá)定位，并用Western blotting方法檢測(cè)肝組織JAK2蛋白的表達(dá)?！?/p>

13、　 4、本研究所有計(jì)量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS13.0軟件，計(jì)量資料采用單因素方差分析，P<0.05為差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?！　?結(jié)果:　　 1、SAP6h、12h和18h組，SAP-AG6h、12h和18組及NC組七組血清ALT、AST、AMY水平總的比較差異有顯著性（P=0.000）。與NC組比較，SAP組與SAP-AG組AMY、ALT、AST水平升高，差異有顯著性（P=0

14、.000）；與SAP組相比，SAP-AG各組血清AMY、ALT、AST水平下降，差異有顯著性（P=0.000）；。　　 2、光鏡下，SAP組胰腺和肝組織病理?yè)p害程度隨時(shí)間明顯加重，與SAP組相比，SAP-AG組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)胰腺病變程度有所減輕，而肝組織損傷程度也有所減輕?！　?3、免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，SAP組和SAP-AG組中JAK2蛋白在肝臟組織中較NC組有所增多，而SAP-AG組較SAP組JAK2蛋白在肝組織中的表達(dá)

15、有所減少?！　?4、SAP6h、12h和18h組，SAP-AG6h、12h和18組及NC組七組JAK2蛋白表達(dá)總的比較差異有顯著性（P=0.000）。Western blotting結(jié)果顯示，SAP組各時(shí)間點(diǎn)JAK2蛋白表達(dá)顯著升高，與NC組相比差異有顯著性（P=0.000）；SAP-AG組各時(shí)間點(diǎn)JAK2蛋白較SAP組顯著減少，差異有顯著性（P=0.000）。 結(jié)論: 1、SAP發(fā)生后，AMY、ALT、AST水

16、平均顯著升高；組織病理學(xué)檢查顯示SAP各組大鼠胰腺組織出現(xiàn)大片的出血、壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；而肝臟組織出現(xiàn)匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、點(diǎn)片狀壞死等改變，且病變均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而進(jìn)行性加重?！　?2、JAK2蛋白在SAP時(shí)高度表達(dá)，并參與了SAP的病理過程，JAK/STAT通路活化可能促進(jìn)SAP肝損傷?！　?3、AG490可顯著減輕SAP肝損傷，其可能是通過抑制JAK2蛋白的表達(dá)，抑制JAK/STAT信號(hào)通路激活，從而對(duì)SAP起到治療