BDL所致幼鼠膽道閉鎖后肝臟纖維化相關(guān)生物分子的時序性變化.pdf

1、目的：膽道閉鎖(BA)是嬰兒早期累及肝內(nèi)外膽道，最終導(dǎo)致終末期肝硬化的嚴重肝臟疾病，其特點為膽管進行性的炎癥、梗阻、纖維化，并最終消失，即使在膽道重建術(shù)后大多數(shù)患兒的肝臟病變也將繼續(xù)進展，最終約有80％的患者需肝移植。本研究結(jié)扎幼鼠肝外膽道模擬新生兒膽道閉鎖肝纖維化，探討這一病理過程的相關(guān)分子在膽道閉鎖肝纖維化過程中發(fā)揮的作用。 方法：⑴選用100只3周Wistar大白鼠幼鼠，體重30-40g，健康，無明顯畸形者。隨機平均分成兩

2、組，一組(50只)實施BDL術(shù)(近肝門端膽總管雙重結(jié)扎，結(jié)扎線之間離斷)，另一組(50只)作為對照組實施假手術(shù)(開腹游離膽總管不結(jié)扎)。術(shù)后相同條件下飼養(yǎng)。⑵分別于術(shù)后3d、7d、14d、21d、28d處死幼鼠，分離取出完整肝臟，統(tǒng)一取同一肝葉作為標本，一部分固定于4％多聚甲醛留作免疫組化，另一部分冷凍于—80度留作RT-PCR。⑶通過RT-PCR檢測各目的基因：炎癥相關(guān)因子TGF-β1，纖維化早期指標：COL1，膽管上皮細胞特異性細胞

3、因子CK19，纖維化指標α—SMA等mRNA表達水平。 結(jié)果：①實驗組幼鼠第二天開始排黃色尿；三天后可見近肝門處較小肝葉出現(xiàn)水樣變性；7天肝臟標本可見水樣變性范圍擴大，在此基礎(chǔ)上伴有黃色脂肪變性；14天肝臟可見水樣變性消失，脂肪變性范圍進一步擴大至較大肝葉；21天脂肪變消失，而肝臟表面出現(xiàn)均勻黃色小粟粒樣結(jié)節(jié)；28天可見肝臟整體體積縮小，顏色加深變黃，可見更為顯著的黃色粟粒樣結(jié)節(jié)。②在假手術(shù)對照組和BDL組幼鼠肝臟中均能檢測出目

4、的基因的表達。可見對照組目的基因mRNA擴增條帶表達較弱，在BDL組表達增強，并且隨著結(jié)扎天數(shù)的增加條帶亮度逐漸增強，尤其TGF-β1及COL1目的條帶增加趨勢明顯，對照組則未見明顯變化趨勢。統(tǒng)計分析顯示兩組TGF-β1及COL1的表達差異從3天開始有統(tǒng)計學(xué)意義，BDL組與對照組中CK19目的基因在第21天、28天表達的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，α—SMA的表達則從第7天開始有統(tǒng)計學(xué)意義。對BDL不同天數(shù)組間的表達研究發(fā)現(xiàn)CK19在3—7天，7

5、—14天，α—SMA在3—7天無統(tǒng)計學(xué)意義，而其他各組均有統(tǒng)計學(xué)意義，各目的基因組間表達呈增長趨勢，其中14天—21天增長速度最快，這種趨勢在α—SMA的表達中尤為明顯。 結(jié)論：通過肝外膽道結(jié)扎造成膽道梗阻的幼鼠，肝臟呈現(xiàn)膽汁淤積性、進行性加重的纖維化表現(xiàn)。本實驗研究發(fā)現(xiàn)BDL組肝臟纖維化相關(guān)基因表達明顯高于對照組，并且隨著梗阻天數(shù)的增加表達量明顯增加。并且本實驗還發(fā)現(xiàn)在肝纖維化過程中的14—21天是纖維化發(fā)生的特殊時期，這一時