版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、膽道閉鎖是臨床上新生兒膽汁淤積性黃疸的常見病因之一,本病最終會(huì)導(dǎo)致肝纖維化及肝硬化的發(fā)生。而目前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)途徑的激活與否與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展及最終結(jié)局相關(guān),是慢性肝臟炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝纖維化過程中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用的通路。在肝臟炎癥反應(yīng)形成肝纖維化的微環(huán)境中,血小板和肝庫普夫細(xì)胞等多種細(xì)胞均可以分泌細(xì)胞因子TGF-β,而在分泌TGF-β的細(xì)胞中,活化的肝星狀細(xì)胞表達(dá)TGF-β較其余細(xì)胞明顯升高,而肝星狀細(xì)
2、胞是形成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞,因此認(rèn)為TGF-β在肝星狀細(xì)胞生成細(xì)胞外基質(zhì)的過程中作為正性的調(diào)節(jié)因子。而細(xì)胞因子TGF-β1是TGF-β家族中3種不同的亞型中明確的早期致纖維化細(xì)胞因子,其活化機(jī)制是TGF-β1與肝星狀細(xì)胞TβR結(jié)合,激活細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的Smads蛋白。因此,TGF-β1/Smads在肝臟炎癥后形成肝纖維化過程中起著重要作用,該通道也是目前研究肝纖維化的一個(gè)熱點(diǎn),而中藥可以有效的延緩肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展,甚至可以有效逆轉(zhuǎn)早期
3、肝纖維化,因此,探討中藥延緩肝纖維的療效機(jī)制有著重要的意義。
對于膽道閉鎖的治療,目前認(rèn)為Kasai術(shù)是有效的治療手段,然而Kasai術(shù)并不能阻止肝纖維化的發(fā)生。對于術(shù)后肝纖維化防治,西醫(yī)主要給予糖皮質(zhì)激素及利膽的熊去氧膽酸治療,臨床上還缺少患者長期獲益的證據(jù),中醫(yī)藥對本病的防治研究起步較晚。本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上,對小兒膽道閉鎖Kasai術(shù)后證候規(guī)律進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示患兒具有陽虛、濕困、血瘀的特點(diǎn),針對此病機(jī)特點(diǎn),運(yùn)用
4、溫陽化濕活血法,以加味茵陳四逆湯為基礎(chǔ)方對小兒膽道閉鎖Kasai術(shù)后進(jìn)行治療,在改善臨床癥狀、延緩肝纖維化的發(fā)生、提高生存質(zhì)量上取得一定療效,但其作用機(jī)理尚不明確,而目前中藥對防治膽道閉鎖肝纖維化機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。
目的:
基于臨床研究的基礎(chǔ)上,從TGF-β1/Smads信號通路方面,研究加味茵陳四逆湯對HSC-T6所致纖維化進(jìn)程的影響,探索其可能的作用機(jī)制及治療靶點(diǎn),為中醫(yī)藥在防治小兒膽道閉鎖Kasai術(shù)后肝纖
5、維化中的運(yùn)用提供依據(jù)。
方法:
1.收集中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院和廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的門診及住院的膽道閉鎖患兒,按照納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)納入觀察病例,按照臨床病例觀察表要求填寫加味茵陳四逆湯干預(yù)后患兒的臨床癥狀改善情況,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2.CCK8檢測加味茵陳四逆湯含藥血清對TGF-β1干預(yù)的大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)活化增值的影響
2.1含藥血清的制備60只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組
6、:空白組,中藥高劑量組,陽性藥物組,藥物給藥劑量參照文獻(xiàn)“藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算”,其中中藥給予正常劑量的2倍制備高劑量含藥血清,使用時(shí)采用空白血清稀釋;空白組給予與中藥相同體積的蒸餾水灌胃,陽性藥物組給予正常劑量;連續(xù)3天,每天給予2次灌服,第4天晨給予1次劑量灌服,2h內(nèi)腹主動(dòng)脈取血,4℃,3000 r/min,離心30 min,將同組大鼠離心所得血清混合,56℃水浴滅活30 min,最后用0.22 um的針頭
7、濾器過濾除菌,分裝后-20℃保存?zhèn)溆?。臨用前用空白大鼠血清將中藥血清稀釋為中、低劑量使用;
2.2細(xì)胞分組空白組(含10%正常大鼠血清-DMEM培養(yǎng)液5 ml)、模型組(含10%正常大鼠血清-DMEM培養(yǎng)液5 ml)、陽性藥物組(含10%正常大鼠陽性藥血清-DMEM培養(yǎng)液5 ml)加味茵陳四逆湯大鼠血清高劑量組(含10%大鼠高劑量血清-DMEM培養(yǎng)液5 ml)、中劑量組(含10%大鼠中劑量血清-DMEM培養(yǎng)液5 ml)、低劑量
8、組(含10%大鼠低劑量血清-DMEM培養(yǎng)液5 ml)、除正常組外,其余各組分別加入TGF-β1(終濃度10 g/L),將各組細(xì)胞置于5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);
2.3 CCK8法檢測吸光度將細(xì)胞數(shù)按5000個(gè)/ml接種至96孔板,每孔100ul,均設(shè)5個(gè)復(fù)孔;分別于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48、72小時(shí)后每孔加入10ul CCK8,繼續(xù)培養(yǎng)半小時(shí)后酶標(biāo)儀檢測450nm處測定吸光度A值,結(jié)果以5個(gè)復(fù)孔A的均值表示。
3.RT-PCR檢
9、測含藥血清對TGF-β1干預(yù)的大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)Tβ R1、Smad3、Smad7、collagenⅠ、collagenⅢmRNA的表達(dá)
3.1含藥血清的制備同2.1及細(xì)胞的分組同2.2;
3.2將空白組、模型組、陽性藥物組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組細(xì)胞置于5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h(細(xì)胞數(shù)>1×105/ml)。培養(yǎng)結(jié)束后用PBS清洗3遍,棄去PBS,用處理過的細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞,并轉(zhuǎn)移
10、至1.5 ml EP管中,4000r/min4℃3 min離心棄上清。采用RT-PCR檢測TβR1、Smad3、Smad7、collagenⅠ、collagenⅢmRNA的表達(dá),以β-action為內(nèi)參照,2-ΔΔCt計(jì)算各基因表達(dá)進(jìn)行分析。
4.Western blot檢測加味茵陳四逆湯含藥血清對TGF-β1干預(yù)的大鼠肝形狀細(xì)胞株(HSC-T6)Tβ R1、Smad3、Smad7、collagenⅠ、collagenⅢ蛋白的
11、表達(dá)
4.1含藥血清的制備同2.1及細(xì)胞的分組同2.2;
4.2將空白組、模型組、陽性藥物組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組細(xì)胞置于5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h(細(xì)胞數(shù)>1×105/ml)。培養(yǎng)結(jié)束后用PBS清洗3遍,棄去PBS,用處理過的細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞,并轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中,4000 r/min4℃3 min離心棄上清。采用Western blot檢測TβR1、Smad3、Smad7、coll
12、agenⅠ、collagenⅢ蛋白的表達(dá),以β-action為內(nèi)參照,以相應(yīng)蛋白灰度結(jié)果與β-action的比值作為相對表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
結(jié)果:
1.加味茵陳四逆湯可以有效改善患兒的黃疸程度、精神狀態(tài)、腹脹程度、嘔吐癥狀、食量、大便的顏色性狀以及患兒肝脾腫大體征,在一定程度改善了患兒生活質(zhì)量,且本研究也顯示加味茵陳四逆湯可有效改善患兒的肝功能及肝纖維化六項(xiàng)等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。
2.給予外源性刺激因子TGF-β
13、1(10ng/m1)刺激,在48小時(shí)后中藥各劑量組含藥血清與空白血清相比均可抑制細(xì)胞的增殖(P<0.05),72h時(shí)后中藥各劑量含藥血清對細(xì)胞的增值與空白血清相比無明顯影響(P>0.05);
3.①TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞模型組Tβ R1 mRNA表達(dá)與空白組相比無顯著差異(P>0.05),陽性藥物組和加味茵陳四逆湯高、中、低劑量組與模型組相比無顯著差異(P>0.05);②TGF-β1誘導(dǎo)的HSC細(xì)胞模型組smad3
14、 mRNA表達(dá)與空白組相比有顯著差異(P<0.05),加味茵陳四逆湯中劑量組與模型組相比有顯著差異(P<0.05);③TGF-β1誘導(dǎo)的HSC細(xì)胞模型組smad7 mRNA表達(dá)與空白組相比無顯著差異(P>0.05),加味茵陳四逆湯各劑量組與模型組相比無顯著差異(P>0.05);④TGF-β1誘導(dǎo)的HSC細(xì)胞模型組collagenⅠ mRNA表達(dá)與空白組相比有顯著差異(P<0.05),加味茵陳四逆湯中劑量組與模型組相比有顯著差異(P<0.
15、05);⑤TGF-β1誘導(dǎo)的HSC細(xì)胞模型組collagenⅢmRNA表達(dá)與空白組相比有顯著差異(P<0.05),加味茵陳四逆湯高劑量組與模型組相比有顯著差異(P<0.05)。
4.①Western blot檢測TβR1蛋白相對表達(dá)量結(jié)果:TβR1多重比較“空白組”與“模型組”,“中藥低劑量組”與“模型組”之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);②Western blot檢測Smad3蛋白相對表達(dá)量結(jié)果:Smad3相對表達(dá)量結(jié)
16、果Smad3多重比較分析“中藥低劑量組”與“模型組”差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);③Smad7蛋白相對表達(dá)量結(jié)果:Smad7多重比較各組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);④collagenⅠ蛋白相對表達(dá)量結(jié)果:collagenⅠ多重比較分析“模型組”與各組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);⑤collagenⅢ相對表達(dá)量結(jié)果:collagenⅢ多重比較分析“模型組”與“空白組”、“陽性藥物組”、“中藥中劑量組”之間的差異有統(tǒng)計(jì)
17、學(xué)意義(P<0.05)。
結(jié)論:
綜上相關(guān)的臨床及離體實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,加味茵陳四逆湯延緩肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展及改善患兒生存質(zhì)量方面的機(jī)制可能通過TGFβ1/Smads信號通路起作用。在本次離體實(shí)驗(yàn)研究中,基因表達(dá)方面:加味茵陳四逆湯含藥血清與模型組相比較可以顯著降低smad3 mRNA、collagenⅠ mRNA、collagenⅢ mRNA的表達(dá),雖然在統(tǒng)計(jì)學(xué)上Tβ R1 mRNA與模型組相比較無明顯差異,但在
18、數(shù)值上較模型組降低明顯;在蛋白表達(dá)方面:加味茵陳四逆湯含藥血清可以顯著降低TβR1、Smad3、collagenⅢ蛋白的表達(dá)。提示加味茵陳四逆湯改善肝纖維化的機(jī)制可能是通過下調(diào)TGFβ1/Smads信號通路中的起正性調(diào)節(jié)作用的TβR1、Smad3蛋白起作用,最終降低膠原蛋白的表達(dá)。然而,本次研究中起抑制作用的Smad7其基因和蛋白均未見明顯的改變,與理論上有一定的差別,這可能提示本藥的治療作用還有其他機(jī)制的參與,這在一定程度上也體現(xiàn)了中
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 加味茵陳四逆湯預(yù)防給藥對肝纖維化幼鼠TGF-β1-Smads通路的影響.pdf
- 膽道閉鎖肝纖維化臨床病理研究.pdf
- 基于TGF-β1-Smads信號通路研究腎纖康抗腎間質(zhì)纖維化的作用及機(jī)制.pdf
- 紅景天甙對大鼠肝組織TGF-β1-Smads信號通路的作用.pdf
- 扶正柔肝湯對肝纖維化的療效及對TGF-β和PDGF的影響.pdf
- 田七注射液對阿霉素腎纖維化大鼠的HGF及TGF-β1-Smads信號通路的影響.pdf
- 溫陽活血方對腎纖維化TGF-β-Smads信號傳導(dǎo)通路的干預(yù)研究.pdf
- 山芝麻酸甲酯對肝星狀細(xì)胞TGF-β1-Smads信號通路的調(diào)控作用機(jī)制.pdf
- 田七注射液對阿霉素腎纖維化大鼠SnoN-TGF-β1-Smads信號通路通路的影響.pdf
- 黃芪基于TGF-β1-Smads通路治療小鼠IgA腎病的機(jī)制研究.pdf
- 養(yǎng)營活血湯對肝纖維化大鼠α-SMA與TGF-β1的影響.pdf
- 姜黃素對急性肺損傷大鼠肺組織TGF-β1-Smads信號通路的影響.pdf
- 膽道閉鎖的肝纖維化評估及Kasai術(shù)后自體肝生存分析.pdf
- 田七注射液對阿霉素腎纖維化大鼠的CTGF-TGF-β1-Smads信號通路的影響.pdf
- 茵陳蒿湯對CCL4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型血清TGFβ1及TGFβR1表達(dá)的影響.pdf
- 田七注射液對阿霉素腎纖維化大鼠的PDGF-BB-TGF-β1-Smads信號通路的影響.pdf
- 護(hù)肝解纖湯治療肝纖維化中CTGF、TGF-β1、PDGF變化的研究.pdf
- 四逆散加味對免疫性肝纖維化大鼠肝組織TGF-β-,1-和IL-1的影響.pdf
- 山奈酚對感染日本血吸蟲小鼠TGF-β1-Smads信號通路的影響.pdf
- 加減三甲散及其拆方滋陰養(yǎng)血藥調(diào)控肝纖維化TGF-β-Smads通路的研究-.pdf
評論
0/150
提交評論