CXCR4基因在腎癌細(xì)胞核中核定位序列的研究.pdf

1、[目的]
　　 研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4核轉(zhuǎn)移與腎癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)旨在探索在SDF-1刺激下引導(dǎo)CXCR4轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核的關(guān)鍵核定位序列，為尋找抑制腎癌轉(zhuǎn)移的物質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步補(bǔ)充SDF-1/CXCR4生物軸的信號(hào)通路機(jī)制內(nèi)容。
　　 [方法]
　　 利用核定位序列預(yù)測(cè)軟件PSORTⅡPrediction(http：//psort.ims.u-tokyo.acjp)進(jìn)行CXCR4核定位序列在線分析，推測(cè)CXCR

2、4的可能核定位序列。以EGFP-CXCR4全長(zhǎng)序列為模板，應(yīng)用over-lapping PCR、酶切等方法獲得CXCR4核定位序列缺失的目的片段。將目的片段連接至pGEM-Teasy載體，酶切鑒定正確后與EGFP-N1分別進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物連接，得到核定位序列缺失的EGFP-CXCR4突變體。將構(gòu)建成功的突變體以及作為對(duì)照組的EGFP-CXCR4全長(zhǎng)序列質(zhì)粒和EGFP-N1空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人腎胚293細(xì)胞，分別加入SDF-1刺激24

3、小時(shí)，同時(shí)設(shè)立不加SDF-1刺激組。光譜激光掃描共聚焦顯微鏡觀察不同質(zhì)粒在人腎胚293細(xì)胞內(nèi)的定位情況，從而判斷軟件預(yù)測(cè)的核定位序列的準(zhǔn)確性。
　　 [結(jié)果]
　　 1.核定位序列軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：CXCR4的核定位序列位于氨基酸序列的第146位開(kāi)始的RPRK，即cDNA序列：AGGCCAAGGAAG；
　　 2.構(gòu)建的EGFP-CXCR4突變體經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定，無(wú)堿基突變和讀碼框偏移，質(zhì)粒構(gòu)建成功；
　　

4、 3.光譜激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染人腎胚293細(xì)胞并加入SDF-1刺激24小時(shí)后EGFP-CXCR4全長(zhǎng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，而EGFP-CXCR4核定位序列缺失的突變體未轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.CXCR4的核定位序列位于氨基酸序列的第146位開(kāi)始的RPRK，與核定位序列預(yù)測(cè)軟件分析結(jié)果相符合；
　　 2.阻斷CXCR4的核定位序列可能有助于抑制腎癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；
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