抗TNF-α小分子抑制劑的研究及抗CD20Fab-TNFα融合蛋白表達載體的構(gòu)建、表達和活性的初步測定.pdf

1、腫瘤壞死因子α(Tumornecrosisfactorα，TNF-α)主要是由巨噬細胞分泌的一種多功能細胞因子，一方面它能殺傷某些腫瘤細胞或使體內(nèi)腫瘤組織發(fā)生出血性壞死；另一方面它又是一種較強的內(nèi)源性炎癥介質(zhì)，過量的TNF-α表達可以引起組織損傷、重癥感染性休克、自身免疫性疾病等，可以說TNF-α作為一個調(diào)節(jié)生理平衡的關(guān)鍵細胞因子，在人類對抗腫瘤及其他疾病中扮演了“雙刃劍”的角色。依據(jù)TNF-α的雙重作用，本實驗課題主要分為兩個部分，首

2、先完成了一類TNF-α小分子抑制劑的設(shè)計、篩選及活性測定，其次對抗CD20Fab-TNFα融合蛋白在B系淋巴瘤中的功能作用進行了初步研究。 在過去的30年中，隨著對某些炎性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病、銀屑病及強直性脊柱炎在細胞和分子水平上病理機理的闡明，人們發(fā)現(xiàn)這些疾病之間有著共同的發(fā)生機制。而由TNF-α及其受體所構(gòu)成的細胞因子信號通路網(wǎng)絡(luò)在炎性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著核心作用。阻斷TNF-α活性已成為治療上述免疫性疾病的

3、主要手段。目前，國際上用于抗TNF-α治療用藥物主要有三種，皆為蛋白類藥物，這些生物大分子一方面具有特異性好、結(jié)合能力強的特點，但另一方面也存在著穩(wěn)定性較差，在患者體內(nèi)易降解并極易產(chǎn)生免疫耐受的缺點。因此，探索新的免疫抑制劑研究策略來研制靶向抗TNF-α的小分子藥物，已成為國內(nèi)當前臨床免疫治療急需解決的難題之一。 本文利用計算機輔助藥物設(shè)計(computer—aideddrugdesign，CADD)，以靶蛋白及其受體的復(fù)合晶體

4、結(jié)構(gòu)為模板，從小分子化合物庫中虛擬篩選出300-500個抗TNF-α的抑制劑，并購買其中的80個代表性化合物做進一步的生物活性測定。包括初步的抑制TNF-α對L929細胞毒性實驗；流式細胞儀法測定篩選的小分子化合物阻斷量子點標記的TNF-α結(jié)合受體的實驗；MTT法進一步分析篩選出的小分子化合物在不同劑量時抑制TNF-α對L929細胞毒性的作用；采用AnnexinV—FITC檢測上述小分子對TNF-α誘導(dǎo)的細胞凋亡的抑制作用。活性篩選結(jié)果

5、顯示有3個小分子化合物對TNF-α有顯著抑制活性；對其中較好的一個進行了深入研究，實驗結(jié)果表明，該化合物能特異性阻斷量子點標記的TNF-α與受體的結(jié)合，并呈劑量依賴性；該化合物具有較強的抑制TNF-α(1ng/ml)對L929細胞毒性的作用，表現(xiàn)為劑量依賴性，半數(shù)抑制濃度(IC50)為10umol/L；該化合物能抑制TNF-α誘導(dǎo)的L929細胞凋亡，并呈劑量依賴性。實驗證明，利用以上計算機虛擬篩選并結(jié)合人工篩選及生物學(xué)活性檢測的方法能夠

6、發(fā)現(xiàn)針對特定靶點的小分子抑制劑。 盡管TNF-α在自身免疫性疾病中起到核心作用，但人們最初認識它卻是作為一個能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生壞死的細胞因子。體外實驗表明，TNF-α具有很強的抗增殖功能和細胞毒性。因此，在上個世紀80年代就被應(yīng)用于惡性腫瘤的臨床治療當中。但全身系統(tǒng)性使用TNF-α治療會產(chǎn)生一些嚴重的不良反應(yīng)，限制了其應(yīng)用。到目前為止，直接利用TNF-α殺滅腫瘤的治療方法進展緩慢，僅局限于在隔離肢體灌注療法中治療黑色素瘤、骨肉

7、瘤等。利用抗體的靶向作用將藥物運輸?shù)侥繕瞬课灰殉蔀楫斍鞍邢蛑委煹闹饕侄魏头椒?。已有研究表明，用單克隆抗體將TNF-α運送到腫瘤組織血管部位，使其在該部位濃集，可以達到破壞腫瘤新生血管從而殺滅腫瘤的目的。CD20是B淋巴細胞上的跨膜蛋白質(zhì)分子，主要參與調(diào)節(jié)B淋巴細胞的增殖與分化，在免疫系統(tǒng)中起重要作用。其在B細胞中特有的表達方式、生物學(xué)作用和存在形式?jīng)Q定了其成為治療B淋巴細胞瘤的主要靶點。研究表明，抗CD20的抗體可直接抑制B淋巴瘤細胞

8、生長并誘導(dǎo)其凋亡的發(fā)生，該凋亡的發(fā)生與鈣離子相關(guān)，并且CD20分子的二聚化和多聚化能夠有效增強其誘導(dǎo)凋亡的能力。本實驗在我室原有抗CD20Fab表達載體的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了抗CD20Fab-TNFα融合蛋白表達載體并表達出可溶性蛋白，之后又對其活性進行了初步的研究探討。證明了CD20Fab部分具有與Raji細胞表面CD20分子的結(jié)合能力，并驗證了融合蛋白TNF-α部分的細胞毒活性。本實驗的創(chuàng)新性在于期望利用CD20抗體的靶向作用將TNF