人次級(jí)淋巴組織趨化因子(SLC)的克隆、表達(dá)和功能鑒定.pdf

1、次級(jí)淋巴組織趨化因子(Secondary Lymphoid-Tissue Chemokine,SLC),即CCL-21,是趨化因子(Chemokine)超家族成員.SLC通過(guò)其受體CCR7誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞和DC(dendritic cell)進(jìn)入次級(jí)淋巴組織,并由DC提呈抗原,激活T淋巴細(xì)胞.因此SLC是引發(fā)特異性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵趨化因子之一.為此我們克隆了SLC成熟蛋白基因,構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)行了重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及生物

2、學(xué)活性的鑒定,旨在為進(jìn)一步研究SLC在移植排斥反應(yīng)、腫瘤發(fā)展與轉(zhuǎn)移和自身免疫性疾病中的作用機(jī)制及應(yīng)用奠定基礎(chǔ).該項(xiàng)研究取得的主要結(jié)果如下:1.通過(guò)從人扁桃體中提取總RNA,RT-PCR成功獲得編碼人SLC成熟蛋白的DNA片段(SLC超始密碼子下游第70-405base),并將該片段插入原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+),成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/SLC(+3),通過(guò)突變?nèi)サ裟康幕蚺c腸激酶位點(diǎn)間的三個(gè)氨基酸,經(jīng)測(cè)序,與G

3、enBank上登錄的人SLC成熟蛋白cDNA序列(登錄號(hào)AB002409)完全一致,獲得SLC天然蛋白的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/SLC.2.將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21trxB(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo),獲得了高水平表達(dá)的融合蛋白(TrxA-SLC),并確定融合蛋白在BL21trxB(DE3)中高效表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件為終濃度1mmol/L的IPTG在37℃誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí).SDS-PAGE分析可見,表達(dá)蛋白的大小約為30kDa

4、,占菌體總蛋白的50﹪以上,可溶性蛋白約占50﹪.用羊抗人SLC多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析顯示,在30 kDa處出現(xiàn)單一陽(yáng)性條帶,而對(duì)照的pET32a(+)/BL21trxB(DE3)誘導(dǎo)菌則無(wú)此反應(yīng).3.將大量表達(dá)的融合蛋白經(jīng)TALON金屬親和樹脂純化、除鹽、腸激酶消化、弱陽(yáng)離子交換層析,得到電泳純的SLC重組蛋白.4.生物學(xué)活性分析顯示,所制備的重組SLC可在體外趨化外周血表達(dá)CCR7的淋巴細(xì)胞,可引起外周血表達(dá)CC