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文檔簡(jiǎn)介
1、機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視與抗腫瘤免疫應(yīng)答在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中起重要作用。然而腫瘤通過(guò)多種機(jī)制逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視,如腫瘤細(xì)胞抗原性弱,缺乏激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的必需成分;腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)分子,形成負(fù)性調(diào)節(jié)微環(huán)境,抑制相關(guān)抗瘤免疫應(yīng)答;腫瘤細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生FasL誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞死亡,以及腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)免疫耐受等。如何增強(qiáng)腫瘤的抗原性,促進(jìn)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答是腫瘤免疫治療研究中急需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。CC族趨化因子21(CCL21)
2、是CC族趨化因子,高表達(dá)于人次級(jí)淋巴組織高內(nèi)皮小靜脈和淋巴結(jié)的T細(xì)胞區(qū)。其受體CCR7表達(dá)于初始T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞。目前研究證明淋巴結(jié)部位CCL21與其相應(yīng)受體CCR7的結(jié)合,可促進(jìn)細(xì)胞向淋巴結(jié)等次級(jí)淋巴組織移動(dòng),與淋巴細(xì)胞歸巢以及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此,在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中,CCL21與CCR7相互作用,雖可促進(jìn)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答,但又可引起腫瘤細(xì)胞向高表達(dá)SLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。我們前期研究表明轉(zhuǎn)染CCL21
3、顯著抑制腫瘤生長(zhǎng),且在腫瘤局部發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞水平明顯升高。
目的:基于上述理論,本課題設(shè)計(jì)采用基因工程技術(shù),構(gòu)建CCL21真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞,使腫瘤細(xì)胞表達(dá)CCL21,通過(guò)旁分泌與自分泌,作用于表達(dá)CCR7的腫瘤細(xì)胞及免疫細(xì)胞,觀察腫瘤源性CCL21增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫原性,探討CCL21誘導(dǎo)的抗瘤效應(yīng)及其機(jī)制。
一、人CCL21真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)
1.人CCL21基因克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建
4、
以正常人脾臟cDNA為模板,RT-PCR技術(shù)獲取編碼CCL21 cDNA,通過(guò)去除終止密碼子,加入Kozak序列,引入EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn),將其克隆入紅色熒光蛋白真核表達(dá)載體,獲得重組質(zhì)粒pDsRed2-N1-CCL21,經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序分析證實(shí),所克隆和構(gòu)建的CCL21 cDNA閱讀框及連接部位序列正確;
2.CCL21真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MCF-7及其表達(dá)
重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞
5、MCF-7,12小時(shí)后通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)細(xì)胞胞內(nèi)紅色熒光表達(dá);收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清,熒光分光光度計(jì)及western blot檢測(cè)結(jié)果表明,CCL21-RFP以分泌型形式表達(dá),并在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)達(dá)到高峰;
3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7,利用G418篩選,有限稀釋克隆化,獲得抗性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,通過(guò)熒光顯微鏡觀察,證實(shí)95[%]以上的細(xì)胞表達(dá)紅色熒光,通過(guò)westernblot證實(shí),CC
6、L21持續(xù)分泌至上清,命名為MCF-7-CCL21。
二、轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7增強(qiáng)MCF-7免疫原性及其機(jī)制
1.分組
1)未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MCF-7對(duì)照組:MCF-7
2)轉(zhuǎn)染空載體pDsRed2-N1的MCF-7對(duì)照組:MCF-7-vector
3)轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7實(shí)驗(yàn)組:MCF-7-CCL21
4)MCF-7-vector與MCF-7混
7、合培養(yǎng)組:MCF-7-vector與MCF-7以1:10比例混合
5)MCF-7-CCL21與 MCF-7混合培養(yǎng)組:MCF-7-CCL21與MCF-7以1:10比例混合
2.方法:
1)間接免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞表面HLA-I類(lèi)分子表達(dá);Western blot觀察腫瘤細(xì)胞中抗原轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP-1)表達(dá);
2)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)FasL mRNA水平;ELI
8、SA檢測(cè)培養(yǎng)上清中生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子TGF-β含量;
3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)絲裂霉素C誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;
4) PI染色觀察凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)的外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖。
3.結(jié)果:
1)與未轉(zhuǎn)染以及轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組比較,轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7表面HLA-I類(lèi)分子和胞內(nèi)TAP-1蛋白表達(dá)增高,激發(fā)PBMC增殖;MCF-7-CCL21胞內(nèi)FasL合成減少,培養(yǎng)上清中TGF-β含量明顯降低,結(jié)果提示
9、轉(zhuǎn)染CCL21可增強(qiáng)其免疫原性;
2)轉(zhuǎn)染CCL21可促進(jìn)絲裂霉素C誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,且凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)的PBMC殺瘤作用增強(qiáng),表明MCF-7表達(dá)的CCL21不僅可促進(jìn)絲裂霉素C誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,同時(shí)可能提供危險(xiǎn)信號(hào),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫原性,有效誘導(dǎo)PBMC殺瘤效應(yīng);
3)轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7與MCF-7混合培養(yǎng)組與空載體轉(zhuǎn)染混合培養(yǎng)組比較,通過(guò)上述指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明,腫瘤源性CCL21不僅可促進(jìn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫
10、原性,同時(shí)可增強(qiáng)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫原性。
三、CCL21轉(zhuǎn)染MCF-7對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞抗原提呈及其凋亡的影響
1.分組
1)空白對(duì)照組:樹(shù)突狀細(xì)胞以生理鹽水刺激
2)MCF-7刺激組:未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MCF-7刺激樹(shù)突狀細(xì)胞
3)MCF-7-vector:轉(zhuǎn)染空載體的MCF-7刺激樹(shù)突狀細(xì)胞
4)MCF-7-CCL21:轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7刺激樹(shù)突狀細(xì)胞
11、r> 2.方法:
1)DC制備:應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,培養(yǎng)8 h后吸取懸浮細(xì)胞,貼壁細(xì)胞加入GM-CSF與IL-4,培養(yǎng)5天
2)DC刺激:MCF-7、轉(zhuǎn)染空載體的MCF-7及轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7經(jīng)過(guò)絲裂霉素C處理后作為刺激細(xì)胞,分別與DC以1:1比例混合培養(yǎng)48h
3)應(yīng)用多重濃度淋巴細(xì)胞分離液分離DC
①趨化實(shí)驗(yàn)觀察各組DC的遷移能力
12、 ②流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC吞噬FITC標(biāo)記葡聚糖
③實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)DC的CD80,CD86 mRNA的表達(dá)
④Western blot檢測(cè)DC細(xì)胞胞內(nèi)TAP-1的表達(dá)
⑤應(yīng)用ANNEXIN-V抗體流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC凋亡
⑥Western blot檢測(cè) DC內(nèi)Caspase-3,bcl-2表達(dá)
⑦螢火蟲(chóng)熒光素酶標(biāo)記的NF-kB啟動(dòng)子化學(xué)發(fā)光發(fā)檢測(cè)NF-kB活性
13、 4)上述致敏DC與自體淋巴細(xì)胞以1:5比例混合培養(yǎng),7天后收集淋巴細(xì)胞。將此淋巴細(xì)胞與CFSE標(biāo)記的MCF-7以1:50比例混合培養(yǎng),作用24h
①PI染色,F(xiàn)CM測(cè)定致敏淋巴細(xì)胞對(duì)CFSE標(biāo)記的MCF-7胞毒效應(yīng)
②FCM檢測(cè)表達(dá)穿孔素的CD8+T細(xì)胞與不表達(dá)穿孔素的CD8+T細(xì)胞比例
③取培養(yǎng)上清,ELISA檢測(cè)IFN-γ、TNF-α、IL-10
3.結(jié)果:
14、 1)與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組比較,轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7刺激的DC遷移與吞噬能力均明顯增強(qiáng),胞內(nèi)TAP-1表達(dá)升高,以及CD80,CD86 mRNA表達(dá)升高,以上結(jié)果提示轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7刺激的DC抗原提呈能力增強(qiáng);
2)轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7刺激的DC凋亡率與Caspase-3表達(dá)降低,bcl-2表達(dá)升高;
3)轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7刺激的DC其N(xiāo)F-κB活性增高;
15、4)轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7刺激的DC誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞中表達(dá)穿孔素CD8+T細(xì)胞增多,對(duì)MCF-7胞毒效應(yīng)明顯增強(qiáng),IFN-γ,TNF-α的分泌增加,而IL-10的分泌減少,提示轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7刺激的DC可有效激活抗腫瘤特異性T細(xì)胞,增強(qiáng)抗瘤效應(yīng)。
結(jié)論:通過(guò)轉(zhuǎn)染CCL21至腫瘤細(xì)胞,可提高腫瘤細(xì)胞免疫原性,增強(qiáng)絲裂霉素C誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡,腫瘤源性CCL21促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞抗原提呈,有效誘導(dǎo)抗腫瘤特異性T細(xì)胞的殺
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