9型腺相關(guān)病毒介導(dǎo)R65核酶基因轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)NF-κB信號(hào)通路干預(yù)的研究.pdf

1、目的：以9型腺相關(guān)病毒（Recombinant Adeno-associated Virus Serotyoe9, rAAV9）為載體介導(dǎo)R65核酶基因重組成rAAV9-eGFP-R65轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs），觀察是否能抑制氧化型低密度脂蛋白（Oxidized Low Density Lipoprotein，ox-LDL）誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞N

2、F-κB通路的激活，進(jìn)而減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。
　　方法：傳代培養(yǎng)HUVECs，用rAAV9轉(zhuǎn)染HUVECs細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，選擇最佳轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并檢測(cè) rAAV9的HUVECs和人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（Human Aortic Smooth Muscle Cells，HASMCs）的轉(zhuǎn)染效率區(qū)別。氧化型低密度脂蛋白（Oxidized Low Density Lipoprotein，ox-LDL）誘導(dǎo)HU

3、VECs細(xì)胞激活NF-κB通路，rAAV9-eGFP-R65轉(zhuǎn)染HUVECs抑制ox-LDL誘導(dǎo)的NF-κB激活，Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞P65和P50蛋白的表達(dá)，免疫熒光定位檢測(cè) NF-κB通路 P65和P50的轉(zhuǎn)位激活，ELISA檢測(cè)NF-κB通路下游相關(guān)蛋白表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：（1）流式結(jié)果顯示當(dāng) MOI為1×107 v.g./cel1時(shí)rAAV9-eGFP-R65在HUVECs和HAS

4、MCs的轉(zhuǎn)染效率分別為(52.8±2.05)％和(52.40±3.21)％。倒置熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀結(jié)果均顯示rAAV9-eGFP-R65可高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HUVECs和HASMCs，eGFP的表達(dá)高峰分別在第6天和第5天。（2）Western blot結(jié)果顯示：ox-LDL或高脂血清均可誘導(dǎo)HUVECs激活NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致P65和P50核蛋白表達(dá)增高，并且ox-LDL誘導(dǎo)存在濃度和時(shí)間劑量關(guān)系。（3）Western blot結(jié)果

5、顯示 rAAV9-eGFP-R65轉(zhuǎn)染HUVECs可顯著抑制NF-κB通路P65和P50核蛋白表達(dá)。免疫熒光定位檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，rAAV9-eGFP-R65轉(zhuǎn)染組可明顯減輕ox-LDL誘導(dǎo)的P65核轉(zhuǎn)位。（4）ELISA結(jié)果顯示，rAAV9-eGFP-R65轉(zhuǎn)導(dǎo)可有效減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞炎性損傷和細(xì)胞內(nèi)皮功能損傷。（5）流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，rAAV9-eGFP-R65轉(zhuǎn)導(dǎo)可有效減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞凋亡。