LAPTM4B基因與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其臨床意義.pdf

1、目的:
　　檢測LAPTM4B(溶酶體相關(guān)4次跨膜蛋白B)基因在人肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)組織中的表達情況,并通過體外干擾實驗研究LAPTM4B對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,分析LAPTM4B與HCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其臨床意義。
　　方法:
　　1.采用熒光實時定量RT-PCR(RealtimeRCR)技術(shù)檢測51例HCC、51例癌旁肝組織及6例血管瘤旁正常肝組織中LAPTM4

2、BmRNA的表達;采用免疫組織化學(xué)染色法檢測HCC和癌旁肝組織(各94例)中LAPTM4B-35蛋白的表達;采用蛋白免疫印跡(WesternBlot)方法檢測HCC、癌旁肝組織及遠(yuǎn)癌肝組織(各15例)中LAPTM4B-35蛋白的表達,分析肝癌組織中LAPTM4BmRNA的表達與其臨床病理學(xué)特征的關(guān)系,探討其在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的意義。
　　2.化學(xué)合成并篩選有效的LAPTM4B-siRNA序列,體外瞬時轉(zhuǎn)染人肝癌Huh7細(xì)胞,干擾

3、Huh7細(xì)胞中LAPTM4BmRNA和蛋白的表達。通過MTT方法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell體外侵襲和遷移實驗檢測LAPTM4B基因阻斷前后Huh7細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲能力的變化,并檢測LAPTM4B下游增殖等相關(guān)基因的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.LAPTM4BmRNA和LAPTM4B-35蛋白在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁、遠(yuǎn)癌及正常肝組織(P<0.05)。
　　2.LAPTM4BmRNA表達與HCC

4、患者年齡、術(shù)前AFP水平、BCLC分期及HBsAg感染與否均有關(guān)。LAPTM4BmRNA的表達與患者年齡負(fù)相關(guān)(P<0.01),與患者術(shù)前血清AFP含量正相關(guān)(P<0.05),其在BCLC分期的c期的表達高于0~b期(P<0.05),在HBsAg陽性組的表達量高于HBsAg陰性組(P<0.05)。LAPTM4B基因的表達與性別、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目及肝硬化背景無關(guān)。
　　3.篩選出干擾效果最好的LAPTM4B-siRNA片段,干擾效

5、率達69.11％。瞬時轉(zhuǎn)染后,經(jīng)RealtimePCR、WesternBlot和免疫細(xì)胞化學(xué)方法證實,Huh7細(xì)胞中LAPTM4BmRNA和蛋白質(zhì)表達均受到顯著干擾。
　　4.MTT結(jié)果顯示,LAPTM4B干擾后Huh7細(xì)胞增殖能力明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)顯示,LAPTM4B的干擾可影響Huh7細(xì)胞的細(xì)胞周期分布,處于S期的細(xì)胞比例下調(diào);LAPTM4B干擾后Huh7細(xì)胞凋亡率增加。

6、r>　　6.遷移實驗顯示,與FAM-NC-siRNA組比較,LAPTM4B-siRNA組細(xì)胞的體外運動能力顯著降低(P<0.01)。侵襲實驗顯示,LAPTM4B-siRNA組細(xì)胞比FAM-NC-siRNA組細(xì)胞的體外侵襲能力顯著下降(P<0.01)。
　　7.RealtimePCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),LAPTM4B基因干擾后的Huh7細(xì)胞中cyclinE的表達明顯下調(diào);Cdkn1B、P53、P16的表達明顯上調(diào)。
　　結(jié)論: