過表達CXCR4的骨髓間充質(zhì)干細胞歸巢治療潰瘍性結(jié)腸炎及復方苦參湯的協(xié)同作用研究.pdf

1、本文分三個部分進行探討：
　　第一部分：CXCR4基因過表達慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　目的：探討構(gòu)建大鼠趨化因子受體4（chemokine receptor4，CXCR4）基因過表達慢病毒載體的技術(shù)方法并檢測其體外表達目的基因的水平。
　　方法：設(shè)計CXCR4基因引物，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增CXCR4基因片段；用AgeⅠ酶切GV208載體；通過連接酶將CXCR4基因片段連接至線性化的GV208載體上；運用PC

2、R方法鑒定陽性克隆的CXCR4-GV208載體；按GV208慢病毒包裝試劑盒說明書包裝慢病毒并運用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)法行滴度檢測；然后用重組慢病毒轉(zhuǎn)染人胚腎細胞(293T細胞)，觀察GFP表達情況。
　　結(jié)果：通過PCR成功地擴增了CXCR4基因片段并連接到了GV208病毒載體上，通過PCR及DNA測序鑒定，證明CXCR4-GV208質(zhì)粒構(gòu)建正確，重組慢病毒轉(zhuǎn)染293T細胞后可觀察到熒光及蛋白表達。包裝過表達慢

3、病毒并測其濃縮滴度為2.0×108 TU/mL。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建CXCR4-GV208慢病毒載體，為CXCR4基因的后期研究提供了實驗基礎(chǔ)。
　　第二部分：SDF-1α/CXCR4軸促進間充質(zhì)干細胞歸巢于實驗性結(jié)腸炎受損結(jié)腸及復方苦參湯的協(xié)同效應(yīng)
　　目的：調(diào)查基質(zhì)細胞衍生因子（SDF-1α）/趨化因子受體4（CXCR4）軸在骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）治療2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的結(jié)腸炎中的作用

4、及復方苦參湯的協(xié)同效應(yīng)。
　　方法：從SD大鼠骨髓中分離BMSCs并使用流式細胞術(shù)鑒定。通過慢病毒技術(shù)使BMSCs表達GFP（Ad-GFP-BMSCs）或共表達CXCR4和GFP（Ad-CXCR4-BMSCs），Western blot檢測BMSCs轉(zhuǎn)染前后CXCR4蛋白表達。40只大鼠被隨機分成5組（n=8）：空白組、模型組、Ad-GFP-BMSCs組、Ad-CXCR4-BMSCs組和二聯(lián)組。采用TNBS誘導實驗性結(jié)腸炎，尾靜脈

5、注射Ad-CXCR4-BMSCs或Ad-GFP-BMSCs，二聯(lián)組予復方苦參湯灌胃治療。細胞和中藥治療1 wk后收集結(jié)腸組織，免疫熒光或western blot檢測結(jié)腸部位GFP、CXCR4和SDF-1α表達。
　　結(jié)果：慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后BMSCs的存活率大約為90％，80％的BMSCs能夠穩(wěn)定表達GFP。相對于空白組，結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸部位SDF-1α蛋白表達明顯上升。第12 d，Ad-GFP-BMSCs組結(jié)腸只能發(fā)現(xiàn)少量的綠色

6、熒光表達。相對于Ad-GFP-BMSCs組，Ad-CXCR4-BMSCs組和二聯(lián)組結(jié)腸部位則能發(fā)現(xiàn)綠色熒光表達顯著增多。類似的是，Western blot顯示Ad-GFP-BMSCs組結(jié)腸部位僅表達少量的GFP蛋白；相對于Ad-GFP-BMSCs組，Ad-CXCR4-BMSCs組結(jié)腸部位GFP蛋白表達量則明顯增多（P＜0.05）；相對于Ad-CXCR4-BMSCs組，二聯(lián)組GFP蛋白表達顯著提高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：SDF

7、-1α/CXCR4軸在BMSCs歸巢于受損的結(jié)腸組織中發(fā)揮重要的作用，復方苦參湯可能協(xié)同改善BMSCs的歸巢效率。這可能為潰瘍性結(jié)腸炎的細胞治療提供潛在的方法和理論依據(jù)。
　　第三部分：過表達CXCR4的骨髓間充質(zhì)干細胞治療實驗性結(jié)腸炎的免疫機制研究
　　目的：調(diào)查過表達CXCR4的骨髓間充質(zhì)干細胞治療2，4，6-三硝基苯磺酸誘導的實驗性結(jié)腸炎的效果及其潛在的免疫作用機制。
　　方法：從雌性SD大鼠骨髓中分離BMSCs

8、并使用流式細胞術(shù)鑒定。通過慢病毒技術(shù)使BMSCs表達GFP（Ad-GFP-BMSCs）或共表達CXCR4和GFP（Ad-CXCR4-BMSCs），40只大鼠被隨機分成5組（n=8）：空白組、模型組、Ad-GFP- BMSCs組、Ad-CXCR4-BMSCs組和二聯(lián)組。采用 TNBS誘導實驗性結(jié)腸炎，尾靜脈注射Ad-CXCR4-BMSCs或Ad-GFP-BMSCs，二聯(lián)組予復方苦參湯灌胃治療。在整個實驗過程中，每天記錄大鼠的DAI。治療1

9、 wk后，收集結(jié)腸組織進行HE染色和病理學分析。PCR檢測結(jié)腸部位IFN-γ、IL-6和Il-10的mRNA表達，Western blot檢測STAT-3和磷酸化STAT-3蛋白表達。
　　結(jié)果：相對于空白組，模型組結(jié)腸部位的IFN-γ、IL-6和IL-10的mRNA表達顯著上升，STAT-3及磷酸化STAT-3的蛋白表達明顯上升（P＜0.05）。系統(tǒng)治療一周后，相對于模型組，Ad-GFP-BMSCs組大鼠的臨床癥狀及結(jié)腸病理損害

10、并沒有得到有效的緩解。相對于Ad-GFP-BMSCs組，Ad-CXCR4-BMSCs組和二聯(lián)組大鼠的DAI及病理炎癥分數(shù)顯著降低，結(jié)腸長度明顯恢復。大鼠結(jié)腸組織的IFN-γ、IL-6的mRNA表達顯著下降，IL-10的mRNA表達顯著上升（P＜0.05）；STAT3及磷酸化STAT-3的蛋白表達顯著下降（P＜0.05）。
　　結(jié)論：過表達CXCR4的BMSCs可能通過抗炎及免疫調(diào)節(jié)機制來緩解實驗性結(jié)腸炎，這可能為BMSCs治療UC