骨骼間充質(zhì)干細胞移植對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用.pdf

1、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)屬炎癥性腸病(inflammatorybowel disease,IBD),呈慢性、反復發(fā)作性。近年來,UC發(fā)病率呈逐漸增長的趨勢,目前對UC的治療尚無特異、有效且無毒副作用的藥物,因此,迫切需要探索新的、有效的治療手段。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有高度自我更新能力,可向三個胚層的細胞分化,在干細胞移植治療和組織工程等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用

2、前景。目前已有MSCs治療IBD的報道,但其在腸道的分化及治療機制仍不十分明確。本實驗擬分離、培養(yǎng)、擴增大鼠骨髓MSCs,DAPI標記后經(jīng)靜脈移植入UC模型大鼠,觀察MSCs對UC的治療效果,并探討其可能的機制。
　　 第一部分、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 1材料與方法
　　 1.1 取3-4周SD大鼠的股骨、脛骨骨髓,貼壁法分離、培養(yǎng)、擴增MSCs。鏡下觀察原代細胞和傳代細胞的形態(tài)和生長情況。

3、流式細胞儀檢測第3代MSCs(P3-MSCs)表達CD29、CD90和CD45的情況。
　　 1.2 取P3-MSCs,分別進行成骨誘導和成脂誘導。
　　 2.結(jié)果：
　　 2.1 MSCs原代培養(yǎng)后3～12h后即見部分細胞貼壁生長。培養(yǎng)3～12d,細胞數(shù)量迅速增多,多呈梭形及漩渦狀排列。傳代后MSCs生長快于原代細胞。P3-MSCs生長滯留期約為24～48h,對數(shù)增殖期約為3～6d,7～8d后進入平臺期,6代后

4、細胞出現(xiàn)衰老征象。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示:P3-MSCs表面標記物CD29、CD90陽性,CD45陰性。CD29、CD90均一性分別為99.82±0.11％、99.84±0.25%。
　　 2.2 MSCs經(jīng)成骨誘導后,細胞變?yōu)槎嘟切位虿灰?guī)則形,Von Kossa染色后有鈣化結(jié)節(jié)形成;對照組仍為長梭形,未見鈣化結(jié)節(jié)形成。MSCs經(jīng)成脂誘導后,細胞變?yōu)閳A形或橢圓形,胞質(zhì)充滿脂滴,油紅O染色脂滴呈橘紅色;對照組細胞仍為長梭形,無脂滴

5、出現(xiàn)。
　　 第二部分、骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療大鼠潰瘍性結(jié)腸炎
　　 1 材料與方法
　　 1.1 DAPI標記P3-MSCs備用。
　　 1.2 SD大鼠45只隨機分為移植組、PBS組和正常對照組。移植組和PBS組用免疫復合法制備UC模型。建模后24h,三組大鼠均經(jīng)尾靜脈注射1mL液體:移植組為DAPI標記的P3-MSCs(3×106)懸液,PBS組及正常對照組為PBS。
　　 1.3 每天觀

6、察動物的癥狀和體征。移植后3d、7d、14d,3組各處死5只,解剖觀察結(jié)腸病變,并制備HE染色石蠟切片,光鏡下觀察結(jié)腸組織病理變化。
　　 1.4 各時間點取移植組結(jié)腸組織,制備冰凍組織切片。熒光顯微鏡下觀察移植的MSCs在結(jié)腸的分布,每組切片在隨機10個高倍(×200)視野下計數(shù)DAPI標記的細胞數(shù)目:免疫熒光染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察移植的MSCs細胞角蛋白(cytokeratin,CK)的表達。
　　 2.結(jié)果：

7、
　　 2.1 DAPI標記后的MSCs細胞核發(fā)明亮藍色熒光,標記后14d仍有約90%的細胞可觀察到熒光。
　　 2.2 移植MSCs后,移植組大鼠癥狀明顯改善。結(jié)腸組織石蠟切片顯示移植后7d、14d移植組結(jié)腸病變的修復均明顯優(yōu)于。PBS組。
　　 2.3 各時間點移植組均見DAPI標記的MSCs,主要分布于黏膜層和黏膜下層,肌層和外膜層偶見,且潰瘍周邊黏膜層的分布略多于正常部位。統(tǒng)計結(jié)果顯示,移植細胞數(shù)隨時間增

8、多,至14d時最多(P＜0.05)。移植后7d、14d,移植組結(jié)腸組織可見少量DAPI標記細胞表達CK。
　　 全文結(jié)論：
　　 1.用貼壁篩選法,成功分離、培養(yǎng)和擴增大鼠骨髓MSCs。流式細胞儀檢測顯示培養(yǎng)的P3-MSCs具有MSCs的表型特征。
　　 2.P3-MSCs在體外可誘導分化為成骨細胞和脂肪細胞,證明所分離的MSCs具有多向分化的能力。
　　 3.經(jīng)尾靜脈移植骨髓MSCs對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎有