食管癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測方法和生物學(xué)特征的研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　 食管癌是我國常見的惡性腫瘤，年死亡率居惡性腫瘤第四位，嚴(yán)重危害人類健康。其中，90％以上都是食管鱗狀細(xì)胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC)。食管癌預(yù)后較差，5年生存率僅15％，手術(shù)切除后，2年生存率也不到30％。由于食管癌缺少明顯的早期癥狀，并且缺乏明確的腫瘤標(biāo)志分子，診斷時(shí)多為中晚期。因此，ESCC需要更好的診斷監(jiān)測的方法和更多的診斷、治療和預(yù)后相關(guān)的新分子靶

2、點(diǎn)，提高ESCC的檢出率和診治水平。
　　 目前，檢測腫瘤的方法主要有活組織病理檢測及影像學(xué)檢查等。但是，采集組織學(xué)標(biāo)本創(chuàng)傷大，患者一般較痛苦，難以接受;而影像學(xué)檢查無法檢測到2毫米以下的腫瘤病灶。外周血取材方便，創(chuàng)傷小，是臨床上常規(guī)檢測較為理想的標(biāo)本來源。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells，CTCs)檢測手段簡便、易行、快捷，所以逐漸被人們所重視。
　　 惡性腫瘤患者血液中存在CTCs，也稱

3、為血液稀有細(xì)胞、腫瘤微小轉(zhuǎn)移病灶、潛伏腫瘤細(xì)胞和循環(huán)上皮細(xì)胞(circulatingepithelialcell，CEC)等，是上皮來源的惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的早期事件，有關(guān)CTCs的理論已有很長時(shí)間。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多步驟多因素的復(fù)雜過程，是腫瘤細(xì)胞播散種植生長的串聯(lián)放大的瀑布反應(yīng)。目前腫瘤的發(fā)現(xiàn)和診斷仍主要依賴于影像學(xué)檢查及腫瘤特異性血清標(biāo)志物的檢測，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。由于腫瘤細(xì)胞經(jīng)過血液循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)播散至遠(yuǎn)端器官并且形成

4、的明顯轉(zhuǎn)移灶是惡性腫瘤最主要的死亡原因，因此CTCs檢測能夠?yàn)槟[瘤早期發(fā)現(xiàn)及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)測提供一種有效手段。
　　 研究表明，CTCs數(shù)量及表型的改變可作為了解惡性腫瘤生物學(xué)特征及腫瘤進(jìn)展的窗口，經(jīng)過非侵入性的檢測方法檢測CTCs，為腫瘤早期篩查、腫瘤治療的療效評價(jià)、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)測和預(yù)后判斷等提供必要的信息，然而常規(guī)的檢測手段很難發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞。目前，采用何種方法鑒定外周血中的CTCs，以及如何找到更多的CTCs特異性標(biāo)志物，以提高C

5、TCs檢測的敏感性和特異性，成為該領(lǐng)域研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　 本研究首先采用基于免疫磁珠的負(fù)性篩選食管癌外周血中CTCs的方法，分析CTCs與食管癌進(jìn)展的關(guān)系?？偨Y(jié)了CTCs與食管癌分期、腫瘤體積大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移以及患者生存時(shí)間等的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分化程度越差、TNM分期越高，外周血CTCs檢出數(shù)量越多。CTCs水平高可能提示預(yù)后不良。外周血CTCs的檢出率，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的，腫瘤浸潤程度高的高

6、于浸潤程度低的，腫瘤分期高的高于腫瘤分期低的，分化程度差的高于分化程度好的。術(shù)前CTCs分組(以5為界值)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的顯著因素，術(shù)前CTC≥5組和CTC＜5組相比，病人死亡的風(fēng)險(xiǎn)為3.078倍;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組相比，病人死亡的風(fēng)險(xiǎn)為3.331倍。
　　 同時(shí)，追蹤了一例ESCC病例，動(dòng)態(tài)監(jiān)測不同治療階段患者外周血中CTCs細(xì)胞形態(tài)特征及數(shù)量變化，結(jié)合影像學(xué)及血清學(xué)標(biāo)志，探討其與治療療效及腫瘤進(jìn)展的關(guān)系，進(jìn)

7、一步證實(shí)了CTCs對于腫瘤診斷和預(yù)后的價(jià)值。
　　 由于腫瘤具有異質(zhì)性，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中腫瘤細(xì)胞會(huì)發(fā)生上皮間葉轉(zhuǎn)變(epithelialmesenchymaltransformation，EMT)及間葉上皮轉(zhuǎn)變(mesenchymalepithelialtransition，MET)等過程，細(xì)胞的各種標(biāo)志會(huì)隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展而改變。CTCs脫離原發(fā)灶后，在隨后的變異中有部分細(xì)胞獲得了高轉(zhuǎn)移潛能，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞表型丟失而間葉

8、細(xì)胞表型增加。目前，CTCs的檢測主要是基于分離和富集循環(huán)血液中的具有上皮細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞。美國FDA于2004年批準(zhǔn)的CellSearchProcedure，即采用抗上皮細(xì)胞標(biāo)志EpCAM、CK8、CK18和CK19結(jié)合免疫磁珠富集外周血中CTCs。但是，由于大約20-30％的惡性腫瘤細(xì)胞本身不表達(dá)上皮標(biāo)志或是表達(dá)水平很低，因而這一篩選方法會(huì)造成一部分腫瘤細(xì)胞檢測不到。利用CTCs物理性質(zhì)(如細(xì)胞大小)進(jìn)行分離鑒定，也由于腫瘤細(xì)胞的

9、異質(zhì)性，細(xì)胞大小差異很大，存在特異性不高、富集效率低的問題。
　　 抗體研究是腫瘤的分子靶向治療及腫瘤檢測這一領(lǐng)域的基礎(chǔ)和亮點(diǎn)。然而真正批準(zhǔn)用于腫瘤檢測和治療的抗體相對較少。其中噬菌體抗體庫就是一個(gè)篩選獲得人源抗體的重要技術(shù)平臺(tái)，也是獲得人源抗腫瘤抗體的重要途徑。此技術(shù)是將抗體多樣性可變區(qū)基因組裝到表達(dá)載體內(nèi)，抗體分子片段與噬菌體外殼蛋白融合表達(dá)到噬菌體顆粒表面，從而得到多樣性噬菌體抗體的集合。噬菌體抗體庫能將基因型與表型統(tǒng)一于

10、一體，將選擇能力與擴(kuò)增能力偶聯(lián)起來，在體外模擬體內(nèi)的抗體生成過程，具有強(qiáng)大的篩選能力。
　　 本研究探索了通過人源大容量單鏈?zhǔn)删w抗體庫篩選得到與食管癌細(xì)胞有結(jié)合活性的抗體。不僅對利用噬菌體抗體庫篩選腫瘤細(xì)胞的方法策略進(jìn)行了探討，并且在篩選的基礎(chǔ)上得到與食管癌細(xì)胞系特異性結(jié)合的抗體，有助于提高食管癌CTCs的檢測效率，并為食管癌診斷和治療提供候選分子。
　　 概括來講，本課題以負(fù)性篩選CTCs研究為基礎(chǔ)，通過外周血CTC

11、s窗口，探討CTCs數(shù)量和細(xì)胞形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化與ESCC危險(xiǎn)分級(jí)、輔助治療、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系;以食管癌細(xì)胞為靶，采用大容量噬菌體抗體庫技術(shù)篩選抗食管癌CTCs的特異性單鏈抗體，為分離富集并鑒定食管癌患者外周血CTCs提供高靈敏度和特異度的檢測方法和潛在靶標(biāo)。本研究不僅對食管癌患者實(shí)現(xiàn)個(gè)體化診療具有重要意義，而且可能為食管癌生物治療提供新的候選藥物。
　　 方法:
　　 第一部分:本實(shí)驗(yàn)選取59例食管癌患者，應(yīng)用免疫磁珠為基

12、礎(chǔ)的負(fù)性富集結(jié)合免疫熒光抗體鑒定的方法對其外周血CTCs進(jìn)行檢測。首先通過標(biāo)記抗CD45的Miltineyi納米磁珠與白細(xì)胞結(jié)合，通過強(qiáng)磁場時(shí)去除白細(xì)胞，富集到外周血稀有細(xì)胞;免疫熒光方法檢測抗上皮標(biāo)志CK8/18/19(+)，抗白細(xì)胞標(biāo)志CD45(-)的細(xì)胞，細(xì)胞核DAPI染色陽性;細(xì)胞大小、細(xì)胞核大小形態(tài)等鑒定方法確定CTCs的數(shù)量及細(xì)胞形態(tài)。探討CTCs和與患者臨床病理參數(shù)的聯(lián)系。
　　 第二部分:隨訪了一例晚期食管癌患者

13、，作為個(gè)案報(bào)道。分別于患者不同治療階段富集和鑒定食管癌患者外周血中CTCs，觀察該患者治療前、后及隨訪過程中CTCs形態(tài)學(xué)和數(shù)量變化，評價(jià)CTCs與治療療效和疾病進(jìn)展的關(guān)系。
　　 第三部分:用構(gòu)建的人源天然大容量噬菌體單鏈抗體庫，以三種人食管癌細(xì)胞系KYSE-170，KYSE-180和EC0156細(xì)胞等量混合為靶，分別采用2％多聚甲醛固定(PF)及活細(xì)胞直接篩選(NF)的方法，聯(lián)合酸性洗脫液洗脫(s)及XL-Blue菌直接感染

14、(c)的策略回收結(jié)合噬菌體，經(jīng)“吸附-洗脫-擴(kuò)增”4輪淘洗，通過細(xì)胞ELISA方法鑒定陽性噬菌體抗體。測定噬菌體抗體的相對親和力并且制備可溶性抗體;進(jìn)一步分析陽性抗體細(xì)胞特異性，用于食管癌外周血CTCs的檢測。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS16.0軟件包完成。論文第一部分，采用x2檢驗(yàn)比較腫瘤不同分期、腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移等因素下不同組別之間CTCs檢出率的差別。跟蹤隨訪觀

15、察病人的病情及預(yù)后，不同CTCs檢出水平患者的生存率計(jì)算用Kaplan-Meier法，兩組生存率比較用Log-rank檢驗(yàn)，單因素死亡率比較采用x2檢驗(yàn)，多因素生存分析采用cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型(ForwardLR法)。論文第三部分，不同篩選方法篩選克隆陽性率、多樣性率間比較用x2檢驗(yàn)。均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:59例食管癌患者術(shù)前外周血中CTCs總檢出率為79.6％

16、(47/59)，所有病例共分離出CTCs細(xì)胞462個(gè)，平均7.83個(gè)(0-72)個(gè)，每毫升外周血約檢出CTCs1.044個(gè)。細(xì)胞分化程度越差、TNM分期越高，外周血CTCs檢出數(shù)量越多。CTCs水平高可能提示預(yù)后不良。不同組別CTCs的檢出率比較結(jié)果如下:淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組外周血CTCs的檢出率高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=6.531，P=0.011);腫瘤浸潤程度高的組較浸潤程度低的組CTCs檢出率高，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

17、意義(x2=5.025，P=0.025);腫瘤分期高的組較腫瘤分期低的組CTCs檢出率高，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=5.025，P=0.025);分化程度差的組較分化程度好的組CTCs的檢出率高，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.883，P=0.027);CTCs與是否腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移雖然在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著性差異(x2=1.506，P=0.304)，但是有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的組CTCs的檢出率相差較大。CTCs的檢出率與患者的性別、年齡、腫瘤大小

18、、腫瘤的位置、吸煙與否沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)聯(lián)系。手術(shù)前外周血中CTCs檢出組及CTCs未檢出組生存率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=3.888，P=0.049)，CTCs未檢出組生存率顯著高于CTCs檢出組;手術(shù)前外周血中CTCs＜5組及CTCs≥5組生存率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=12.388，P＜0.001)，CTCs＜5組生存率顯著高于CTCs≥5組;以術(shù)后CTCs檢測數(shù)量分組，不同分組生存時(shí)間差異雖然不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是生存時(shí)間相差較大。采用

19、影響生存時(shí)間的多因素Cox回歸分析，術(shù)前CTCs分組(以5為界值)(B=1.124，P=0.010)及淋巴轉(zhuǎn)移(B=1.203，P=0.003)是影響預(yù)后的顯著因素，術(shù)前CTC≥5組和CTC＜5組相比，病人死亡的風(fēng)險(xiǎn)為3.078倍，總體相對危險(xiǎn)度的95％可信區(qū)間為1.313～7.231;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組相比，病人死亡的風(fēng)險(xiǎn)為3.331倍，總體相對危險(xiǎn)度的95％可信區(qū)間為1.493～7.430。
　　 第二部分:隨訪的

20、患者自從第一次入院治療到目前共3年的時(shí)間，T3N2M0，臨床分期為Ⅳ期，共采集外周血8次，每次7.5ml，術(shù)前檢測CTCs的數(shù)量為1個(gè)，術(shù)后7天檢測CTCs的數(shù)量為14個(gè)。術(shù)后化療共7次，治療過程中，血清CA19-9、AFP等標(biāo)記物保持正常，原發(fā)瘤免疫組化標(biāo)記:腫瘤細(xì)胞CKAE1/AE3(+++)、CK17(++)、p63(++)、p53(++)、EGFR(+);CK7(-)、CK20(-)、CEA(-)?；颊逤TCs數(shù)量及細(xì)胞形態(tài)的動(dòng)

21、態(tài)變化與疾病的進(jìn)展相關(guān)，并且與影像學(xué)結(jié)果相符。
　　 第三部分:通過大容量噬菌體抗體庫共篩選獲得61株抗食管癌細(xì)胞抗體。細(xì)胞ELISA結(jié)果顯示，酸性洗脫液回收結(jié)合噬菌體后增加XL-Blue菌直接感染步驟，可以有效降低陽性噬菌體的丟失，篩選陽性率11.6％(61/525)。多數(shù)噬菌體抗體與三種食管癌細(xì)胞均有結(jié)合活性，有些抗體則表現(xiàn)出細(xì)胞系特異性。比較靶細(xì)胞的處理方法，PFc、PFs、NFc及NFs四組處理方法獲得抗體陽性率比較，組

22、間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=12.046，P=0.007)，其中NFs組的陽性率最高(16.8％)，PFc組陽性率最低(4.7％);測序結(jié)果NF組的抗體可變區(qū)基因多樣性71.4％(5/7)，顯著高于PF組14.2％(1/7)，兩組多樣性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.667，P=0.031)。細(xì)胞免疫熒光和免疫細(xì)胞化學(xué)分析結(jié)果顯示，具有不同可變區(qū)基因的噬菌體抗體主要定位于食管癌細(xì)胞的細(xì)胞膜，食管癌組織化學(xué)染色結(jié)果顯示得到的抗腫瘤細(xì)胞的噬

23、菌體抗體具有較好的腫瘤組織特異性。篩選到的噬菌體抗體與食管癌腫瘤細(xì)胞系有結(jié)合活性，而與白細(xì)胞不結(jié)合。
　　 結(jié)論:
　　 第一部分:比較患者臨床資料分析后認(rèn)為外周血CTCs同食管癌患者的診斷、治療和預(yù)后有一定的聯(lián)系，提示CTCs的檢測可以輔助食管癌的臨床診斷，對食管癌進(jìn)行CTCs的研究有助于腫瘤的基礎(chǔ)研究、評價(jià)手術(shù)治療的效果和判斷預(yù)后等。
　　 第二部分:食管癌外周血CTCs在手術(shù)前后、治療前后的動(dòng)態(tài)變化可能反映

24、疾病的進(jìn)展和治療的療效，并且基本與影像學(xué)檢查相符，能夠較早地反映疾病的進(jìn)展及治療的療效，對有些血清腫瘤標(biāo)志物為陰性的患者更有意義。外周血中檢測到CTCs或者CTCs數(shù)量的變化反映了該患者的預(yù)后不佳，在治療過程中監(jiān)測CTCs的動(dòng)態(tài)變化可能有助于指導(dǎo)患者的治療，幫助其實(shí)施合適的個(gè)體化治療方案。
　　 第三部分:以完整活細(xì)胞為靶，更易于保留腫瘤表面抗原的天然構(gòu)像和多樣性，通過具有良好多樣性的大容量抗體庫篩選獲得的小分子抗體，在腫瘤示蹤

25、和靶向治療中具有廣闊應(yīng)用前景。利用噬菌體抗體庫篩選得到的抗食管癌細(xì)胞的抗體與食管癌細(xì)胞系有特異性結(jié)合，而與白細(xì)胞無結(jié)合，這樣能夠用來鑒定食管癌患者外周血CTCs，篩選出的單鏈抗體能夠提供更多的抗體靶標(biāo)并且用于腫瘤的免疫治療與腫瘤的檢測。
　　 本研究表明，外周血CTCs的檢出與腫瘤的分期、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系，并且術(shù)前CTCs的數(shù)目與患者的生存時(shí)間等相關(guān)，因此CTCs的檢測可以指導(dǎo)腫瘤治療、為判斷腫瘤預(yù)后提供信息、評

26、價(jià)腫瘤治療效果、監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，是具有可行性的診斷手段。本課題篩選得到的特異性抗體有望進(jìn)一步提高CTCs檢測的敏感性和特異性，使其在腫瘤診治領(lǐng)域得到更為廣泛的應(yīng)用。
　　 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn):
　　 1.本研究提示CTCs數(shù)目和形態(tài)改變與食管癌進(jìn)展密切相關(guān)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測外周血CTCs有助于療效評價(jià)和預(yù)后判斷，指導(dǎo)食管癌個(gè)體化治療。
　　 2.采用大容量單鏈?zhǔn)删w抗體庫篩選抗食管癌的特異性抗體，有助于進(jìn)一步提高CTCs檢測的