低切應(yīng)力對血管內(nèi)皮屏障功能的調(diào)控及SL提取物的干預(yù)機制.pdf

1、研究背景及目的:
　　 隨著社會的發(fā)展，心血管類疾病已成為威脅人類生命健康和生活質(zhì)量的頭號疾病。心血管疾病共同的病理基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)。對動脈粥樣硬化發(fā)病機制的研究一直是醫(yī)藥學(xué)界研究的重點和熱點，到目前為止，對于As的發(fā)病機制尚未明確，但As發(fā)生的始動因素得到了國內(nèi)外研究學(xué)者的普遍共識，即血管內(nèi)皮損傷。血管內(nèi)皮損傷直接導(dǎo)致內(nèi)皮屏障功能障礙，血管內(nèi)皮通透性增高，致病因子侵入內(nèi)皮，誘導(dǎo)As發(fā)生

2、和發(fā)展。在導(dǎo)致血管內(nèi)皮屏障功能障礙的因素中，血流切應(yīng)力具有至關(guān)重要的作用。
　　 血流切應(yīng)力已被證明在As斑塊發(fā)生的局灶性中具有重要作用。在低切應(yīng)力(＜4 dyn· cm-2)血流作用下的動脈血管更易于形成斑塊，而高切應(yīng)力(＞15dyn· cm-2)對血管具有保護的作用。血管內(nèi)皮細胞直接感受血流切應(yīng)力的變化，低切應(yīng)力作用可以引起細胞骨架重構(gòu)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮屏障功能的損害，使血液中的脂質(zhì)等物質(zhì)更易通過內(nèi)皮細胞，促進As的形成。

3、>　　 F-actin(微絲肌動蛋白)是調(diào)節(jié)細胞骨架重構(gòu)的主要收縮蛋白。F-actin重排依賴于肌球蛋白輕鏈(Myosin Light Chain，MLC)的磷酸化。肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin Light Chain Kinase,MLCK)和ROCK/ROK/Rho激酶(Rho Kinase,ROCK)是調(diào)節(jié)MLC磷酸化的兩種重要激酶。研究證實，血流切應(yīng)力對成骨細胞的收縮具有Ca2+依賴性（MLCK通路）和非Ca2+依賴性（RO

4、CK通路）兩種途徑。那么血流切應(yīng)力對臍動脈內(nèi)皮細胞骨架重排的作用是否也具有Ca2+依賴性和非Ca2+依賴性還需要研究證實。參蓮提取物(SL extract)是在中醫(yī)臨床經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)較為公認的As病理機制的“損傷—反應(yīng)學(xué)說”和現(xiàn)代藥理學(xué)研究成果所精選出的防治As有效組方的提取物。本實驗室的前期研究結(jié)果證實，SL提取物能改善血管內(nèi)皮功能，對As有很好的防治作用，但其改善內(nèi)皮功能是否通過抑制內(nèi)皮細胞骨架的改變或重組而起作用未見相

5、關(guān)報道。
　　 因此，本課題以研究參蓮提取物抑制細胞骨架重構(gòu)為目的，從誘導(dǎo)細胞骨架重構(gòu)的關(guān)鍵蛋白——肌球蛋白輕鏈(MLC)的磷酸化為切入點，重點研究SL提取物對介導(dǎo)MLC磷酸化的兩條關(guān)鍵通路:肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)通路和ROCK激酶信號通路的干預(yù)作用，從血流切應(yīng)力角度分析SL提取物抑制細胞骨架重構(gòu)的Ca2+依賴性和非Ca2+依賴性效應(yīng)，探討SL提取物抑制As發(fā)生的作用機制。
　　 研究方法和內(nèi)容:
　　 1

6、.SL提取物對低切應(yīng)力介導(dǎo)的兔頸總動脈粥樣硬化形成的作用研究
　　 首先應(yīng)用頸總動脈套管法建立局部低切應(yīng)力兔動脈粥樣硬化模型。在模型建立的2周、4周和8周，運用電磁血流量計分別檢測套管近心端和對側(cè)的血流量，耳中動脈取血后，應(yīng)用全自動生化儀檢測不同時間點各組動物的全血粘度和血清總膽固醇(Total Cholesterol，TC)、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇(Low Density Lipopro

7、tein Cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HighDensity Lipoprotein Cholesterol，HDL-C)的水平;同時在2周、4周和8周時取血管近心端及對側(cè)相同體位血管，固定后HE染色觀察血管病理情況，掃描電鏡觀察內(nèi)皮形態(tài)變化。
　　 2.SL提取物對低切應(yīng)力誘導(dǎo)的兔頸總動脈粥樣硬化形成的機制研究
　　 在造模并給藥的2周、4周和8周，取頸總動脈套管處的近心端及對側(cè)相同體位的

8、血管，裂解組織后提取蛋白，應(yīng)用Western blot檢測血管組織中肌球蛋白輕鏈(MLC)和MLC的磷酸化水平p-MLC，檢測肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和ROCK/ROK/Rho激酶(ROCK)的表達;免疫組織化學(xué)法檢測不同時間點MLCK蛋白和ROCK蛋白表達水平。
　　 3.SL提取物干預(yù)切應(yīng)力介導(dǎo)的人臍動脈內(nèi)皮細胞鈣內(nèi)流的研究
　　 Bioflux1000控剪應(yīng)力微流通道培養(yǎng)人臍動脈內(nèi)皮細胞;數(shù)控剪切流系統(tǒng)加載不同

9、切應(yīng)力后進行免疫熒光染色，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡實時觀察細胞內(nèi)游離鈣變化。在應(yīng)用MLCK特異性阻斷劑ML-7，ROCK特異性阻斷劑Y-27632及鈣通道阻斷劑Nicardipine干預(yù)的前提下，加載不同切應(yīng)力，觀察SL提取物對低切應(yīng)力依賴的鈣內(nèi)流的影響。
　　 4.SL提取物對切應(yīng)力介導(dǎo)的細胞骨架重排的作用機制研究
　　 BioFlux1000高通量微流系統(tǒng)培養(yǎng)人臍動脈內(nèi)皮細胞，加載切應(yīng)力后，進行免疫熒光染色，應(yīng)用激光共聚

10、焦顯微鏡觀察細胞骨架的變化，分析F-actin、MLCK、ROCK、MLC、p-MLC表達的變化。在應(yīng)用MLCK特異性阻斷劑ML-7、ROCK特異性阻斷劑Y-27632、鈣通道阻斷劑Nicardipine干預(yù)后，觀察SL提取物對切應(yīng)力介導(dǎo)的F-actin、MLCK、ROCK、MLC、p-MLC表達變化的影響，分析SL提取物的作用機制。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.低切應(yīng)力誘導(dǎo)的頸總動脈粥樣硬化兔模型復(fù)制成功:套管近心端形

11、成局部低切應(yīng)力，對側(cè)為正常切應(yīng)力。SL提取物對局部血流具有一定的改善作用，能劑量依賴性的增高血管近心端血流量，明顯改善血流切應(yīng)力;SL提取物能降低As模型兔血脂水平，抑制內(nèi)膜增厚和斑塊的形成;掃描電鏡觀察結(jié)果顯示SL提取物對低切應(yīng)力誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷具有抑制作用。
　　 2.SL提取物能時間依賴性的抑制MLCK和ROCK在近心端的表達，對MLC的磷酸化水平也具有明顯的抑制作用。MLCK在血管的分布變化隨時間的進展具有進行性增高的

12、趨勢，前期主要在內(nèi)膜表達，4周和8周時在中膜和外膜表達較多;ROCK的表達分布主要集中在中膜。
　　 3.低切應(yīng)力可以有效介導(dǎo)HUAEC細胞胞漿游離鈣的增高，其作用具有時間依賴性;HUAEC胞內(nèi)游離鈣的增高作用主要與細胞外鈣的流入有關(guān);SL提取物可以抑制低切應(yīng)力誘導(dǎo)的細胞外鈣內(nèi)流。
　　 4.低切應(yīng)力誘導(dǎo)細胞骨架重構(gòu)的作用與MLC磷酸化水平有關(guān);在低切應(yīng)力作用下，F(xiàn)-actin、MLCK、ROCK、p-MLC/MLC表達