安宮清開靈抑制大鼠腦出血后腦水腫的機(jī)制研究.pdf

1、本論文由文獻(xiàn)綜述和實(shí)驗(yàn)研究?jī)刹糠纸M成。 文獻(xiàn)綜述概述了腦出血后腦水腫形成的原因和中醫(yī)藥對(duì)腦出血的研究狀況。 實(shí)驗(yàn)研究部分包括三方面的內(nèi)容，第一部分主要為與腦水腫形成相關(guān)的損害因素表達(dá)時(shí)間過(guò)程的研究，利用膠原酶誘導(dǎo)大鼠腦出血模型觀察腦出血后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)與7天時(shí)iNOS與MMP-2的表達(dá)情況，并以此討論腦出血后iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性腦水腫、MMP-2破壞血腦屏障誘導(dǎo)的血管源性腦水腫，由此來(lái)研究腦出血后腦水腫

2、的形成原因。第二部分主要為藥效原理研究，通過(guò)給予腦出血大鼠中藥治療，研究藥物對(duì)各種腦水腫引發(fā)因素的作用，分析安宮清開靈注射液抗腦出血腦水腫的作用途徑。第三部分主要為以組織病理為核心的腦水腫藥效學(xué)研究，通過(guò)HE染色比較正常組、模型組、對(duì)照藥組及不同劑量的安宮清開靈組之間的腦組織病理學(xué)改變，直觀地觀察腦出血后腦組織的損傷及安宮清開靈的治療作用，并通過(guò)選用不同劑量的安宮清開靈來(lái)確定藥物治療的最佳劑量。此外，還通過(guò)免疫組化定位分析了腦水腫致發(fā)因

3、素在腦組織中的表達(dá)部位。 研究結(jié)果如下： 1.iMP-2、MMP-9參與了腦出血后腦水腫的形成 MMP-2、MMP-9的過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而破壞血腦屏障的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，誘發(fā)腦出血后局部血腫灶的腦水腫被認(rèn)為是腦出血后產(chǎn)生血管源性腦水腫的重要原因。Abilleira等研究發(fā)現(xiàn)，腦出血患者出現(xiàn)神經(jīng)癥狀24小時(shí)內(nèi)MMP-9濃度顯著升高，并與血腫周圍水腫呈正相關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦出血后48小時(shí)MMP-9表達(dá)

4、達(dá)到峰值，與國(guó)內(nèi)大多實(shí)驗(yàn)研究的觀點(diǎn)相符，提示在腦出血中期(48小時(shí))形成的血管源性腦水腫主要是MMP-9的過(guò)度表達(dá)所致。 國(guó)外早期有實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為MMP-2的表達(dá)與MMP-9不同，從24小時(shí)開始表達(dá)，5天時(shí)達(dá)到峰值，并且維持的時(shí)間較長(zhǎng)，可達(dá)兩周之久，提示可能與巨噬細(xì)胞參與的修復(fù)作用有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ELISA檢測(cè)大鼠血清中MMP-2含量并未發(fā)現(xiàn)24小時(shí)含量的提高，但是在48小時(shí)與72小時(shí)出現(xiàn)了明顯的上升，并于72小時(shí)達(dá)到峰

5、值，7天時(shí)雖有下降，但仍處于高水平，與國(guó)外研究結(jié)果相符。 本實(shí)驗(yàn)研究顯示了安宮清開靈注射液低劑量能夠較顯著的抑制48小時(shí)MMP-9的表達(dá)，中劑量能夠顯著的抑制48小時(shí)MMP-9的表達(dá)，而高劑量的安宮清開靈注射液與作為陽(yáng)性藥的清開靈注射液卻不能夠抑制48小時(shí)MMP-9的表達(dá)，此外在本實(shí)驗(yàn)中亦沒(méi)有觀察到安宮清開靈注射液與清開靈注射液抑制7天時(shí)MMP-9的表達(dá)，清開靈注射液能夠較顯著的抑制48小時(shí)MMP-2的表達(dá)，安宮清開靈注射液各個(gè)

6、劑量都能夠顯著的抑制48小時(shí)MMP-2的表達(dá)，而清開靈注射液與安宮清開靈注射液都不能夠抑制7天時(shí)MMP-2的表達(dá)，通過(guò)與陽(yáng)性藥組及模型組的比較，以及組織病理學(xué)結(jié)果的佐證，發(fā)現(xiàn)安宮清開靈注射液能夠顯著地抑制腦出血急性期的腦水腫。 2.iNOS參與了腦出血后腦水腫的形成 NOS作為N0合成的限速酶，在腦出血后大量表達(dá)(尤其是iNOS)，可能就是腦出血誘導(dǎo)iNOS過(guò)量表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生具有毒性作用的NO，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，加重腦水

7、腫的主要原因。Skula A等的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松減輕腦出血后腦水腫的藥理學(xué)作用正是其抑制了iNOS的表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在大鼠腦出血后48小時(shí)與7天時(shí)iNOS表達(dá)顯著增高，與MMP-2、MMP-9表達(dá)的峰值一致，因此可認(rèn)為腦出血后的腦水腫形成并非由單一因素所引起，而可能是由多種因素共同作用，進(jìn)而加重了腦出血后的損傷，為臨床治療和緩解腦出血后腦水腫的產(chǎn)生提供了基礎(chǔ)研究的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)安宮清開靈注射液各

8、個(gè)劑量組能夠極顯著的抑制腦出血后48小時(shí)和7天時(shí)iNOS的表達(dá)，而清開靈注射液不能夠抑制48小時(shí)iNOS的表達(dá)?？梢?jiàn)安宮清開靈注射液對(duì)于腦出血由iNOS誘導(dǎo)的腦水腫有明顯的治療效果。 3.血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)參與了腦出血后腦水腫的形成 一般研究認(rèn)為VEGF可通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)多種類型的神經(jīng)細(xì)胞具有直接的營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用，增強(qiáng)細(xì)胞活性和存活能力，并能促進(jìn)軸突再生。但是對(duì)于其在腦出血后的作用機(jī)制仍然存在爭(zhēng)議，一

9、些研究認(rèn)為VEGF在腦出血后的局部血腫區(qū)表達(dá)，能夠作用于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR-1和VEGFR-2，從而激活了一系列的損傷信號(hào)通路，誘導(dǎo)新生血管的生成，以此產(chǎn)生腦保護(hù)作用，而另一些研究結(jié)果認(rèn)為VEGF在腦出血后早期即能夠單獨(dú)作用，破壞血腦屏障，加重腦水腫，在腦出血中期又能與其他因素如MMP-9、Ang-2等共同作用增加血腦屏障通透性，導(dǎo)致腦水腫。 在本實(shí)驗(yàn)研究中顯示VEGF在腦出血損傷后的48小時(shí)出現(xiàn)了顯著的提高，在7天