表達(dá)hVEGF-,121--EGFP的間充質(zhì)干細(xì)胞制備及缺氧對其表達(dá)影響.pdf

1、目的：構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子121(hVEGF121)的真核表達(dá)質(zhì)粒并在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)。測定表達(dá)hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及空白骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同時間段的缺氧后VEGF的表達(dá)水平，探討二者的區(qū)別和意義。 方法：一、設(shè)計帶酶切位點的hVEGF121全長擴(kuò)增引物。正義引物5’端加接XhoⅠ酶切位點，反義引物5’端加接EcoRⅠ酶切位點。使用該引物通過PC

2、R技術(shù)擴(kuò)增pCD2/hVEGF121質(zhì)粒中的hVEGF121編碼基因全序列。將PCR產(chǎn)物即帶有相應(yīng)酶切位點的hVEGF121編碼片段，以及載體質(zhì)粒pEGFP-N2用Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，再以粘端連接克隆法將hVEGF121編碼片段定向連接入載體pEGFP-N2的多克隆位點中，構(gòu)建成pEGFP-N2-hVEGF121重組質(zhì)粒。二、采用Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ、HincⅡ酶切法，PCR及DNA序列測定法，分析鑒定所

3、構(gòu)建的重組質(zhì)粒。三、全骨髓差速貼壁法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)，并體外擴(kuò)增數(shù)代。通過形態(tài)學(xué)觀察及表面標(biāo)記物測定鑒定細(xì)胞。四、通過陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-N2-hVEGF121重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的BM-MSCs。五、通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光以檢測hVEGF121/EGFP融合蛋白的表達(dá)。六、將制備好的表達(dá)hVEGF121/EGFP融合蛋白的BM-MSCs在體外缺氧環(huán)境下分別培養(yǎng)6、12、24小時。另設(shè)相同缺氧干預(yù)下

4、的轉(zhuǎn)染空載pEGFP-N2質(zhì)粒的BM-MSCs組、空白BM-MSCs組作為對照。以RT-PCR法檢測VEGF mRNA的表達(dá)量，對比各實驗組的VEGF mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：一、pEGFP-N2-hVEGF121重組質(zhì)粒的構(gòu)建：從pCD2/hVEGF121質(zhì)粒中成功擴(kuò)增出帶酶切位點的hVEGF121全長編碼片段(459bp)。以Xho Ⅰ、EeoR Ⅰ限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切此帶有相應(yīng)酶切位點的hVEGF121編碼片段，以及載體

5、質(zhì)粒pEGFP-N2，所獲片段長度各與預(yù)期長度符合(hVEGF121:453bp，pEGFP-N2：約4.6kbp)，并成功將雙酶切后帶有粘端的片段連接成重組質(zhì)粒。Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ雙酶切所構(gòu)建的重組質(zhì)粒，可以切下-453bp的片段，符合hVEGF121編碼片段大??；HincⅡ酶切所構(gòu)建的重組質(zhì)粒及空載質(zhì)粒，呈一大一小兩片段，重組質(zhì)粒的大片段(4307bp)大于空載質(zhì)粒的大片段(3854bp)，小片段均為883bp，提示重組質(zhì)粒已

6、載有VEGF編碼序列；以普通hVEGF121編碼序列特異性部分?jǐn)U增引物PCR鑒定所構(gòu)建的重組質(zhì)粒，產(chǎn)物符合預(yù)計擴(kuò)增長度317bp；DNA序列測定證實連接至pEGFP-N2多克隆位點內(nèi)的基因片段完全符合hVEGF121編碼序列，表明pEGFP-N2-hVEGF121重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。二、用pEGFP-N2-hVEGF121重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外擴(kuò)增培養(yǎng)的BM-MSCs后，熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光，提示hVEGF121/EGFP蛋白在BM-M

7、SCs中存在表達(dá)。三、在體外模擬心肌缺氧的環(huán)境下分別培養(yǎng)6、12、24小時后，RT-PCR檢測VEGF mRNA表達(dá)水平示：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的BM-MSCs組各時間段缺氧后的VEGF mRNA表達(dá)量皆比對照組高(p＜0.01)，且不同時間段間無統(tǒng)計學(xué)差異。各時間段缺氧后空白BM-MSCs組VEGF mRNA表達(dá)量隨缺氧時程的延長而增加?？瞻譈M-MSCs組及轉(zhuǎn)染空載pEGFP-N2質(zhì)粒的BM-MSCs組的VEGF mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異