自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植對急性心肌梗死家兔Ryanodine受體和其穩(wěn)定蛋白表達的影響.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),心臟移植修復急性心肌梗死后心肌組織是目前醫(yī)學研究熱點。動物實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn)。BMSCs心臟移植能夠抑制急性心肌梗死后的心室重構(gòu),改善心臟功能,但是移植到體內(nèi)的BMSCs具體存活情況、分化成心肌細胞的程度和分化的心肌細胞與原心肌組織的連接關系等問題目前并不完全清楚,BMSCs移植治療缺血性心衰是通過移植細胞分化為新生心肌細胞還是移植細胞

2、旁分泌作用及其確切機制這些問題也不十分明了。Ryanodine受體(Ryanodine receptor,RyR2)是肌漿網(wǎng)上主要鈣離子釋放通道,在心肌的興奮-收縮藕聯(lián)過程中具有重要作用。目前研究還認為RyR2的穩(wěn)定蛋白FKBP12.6在調(diào)控RyR2通道的作用中最為重要。當FKBP12.6與RyR2結(jié)合時,RyR2能穩(wěn)定的處于關閉狀態(tài);當FKBP12.6與RyR2解離時,RyR2通道就處于開放狀態(tài),肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣離子就釋放入胞漿。此外,F

3、KBP12.6還參與調(diào)節(jié)相鄰的RyR2同步開放和關閉。研究發(fā)現(xiàn),心衰時,心肌細胞RyR2和FKBP12.6表達下降,RyR2結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常引發(fā)RyR2鈣滲漏增加,使肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣貯存減少,收縮期肌漿網(wǎng)釋放鈣減少,導致心肌收縮力減弱,心功能降低。另外,RyR2鈣釋放通道數(shù)量減少,還進一步減少心肌收縮期肌漿網(wǎng)鈣釋放量,加重心肌收縮力降低,使心衰加重。實時熒光定量PCR是目前國內(nèi)分子生物研究中的新方法,比半定量PCR檢測結(jié)果準確性高。因此,我

4、們實驗通過BMSCs心臟移植修復急性心肌梗死后心肌,應用實時熒光定量PCR方法檢測心肌RyR2和FKBP12.6 mRNA,研究BMSCs心臟移植治療缺血性心力衰竭的機制。
　　 目的:通過密度梯度離心法和貼壁法獲得BMSCs,觀察自體BMSCs心臟移植對心肌梗死家兔心肌Ryanodine受體和其穩(wěn)定蛋白(FKBP12.6)表達的影響及經(jīng)5-氮胞苷誘導后體外培養(yǎng)4周的BMSCs的超微結(jié)構(gòu),探討B(tài)MSCs心臟移植治療缺血性心力衰竭

5、的機制。
　　 方法:將30只新西蘭白兔隨機分為三組:對照組(只開胸但不結(jié)扎冠狀動脈前降支)、AMI組(開胸結(jié)扎冠狀動脈前降支)和BMSCs組(開胸結(jié)扎冠狀動脈前降支加BMSCs移植)。采用結(jié)扎冠狀動脈前降支的方法制備急性心肌梗死動物模型。利用密度梯度離心法和貼壁法獲得BMSCs,經(jīng)5-氮胞苷誘導后,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)標記。當家兔AMI模型制備后的第10天時,在BMSCs組,將600μl DAPI標記的1

6、.0×107個BMSCs懸液用微量注射器分別按4點直接注入梗死灶邊緣區(qū)域;在AMI組,注射等體積的無血清DMEM液。在移植后4周時,利用實時熒光定量RT-PCR法檢測梗死邊緣區(qū)RyR2和FKBP12.6 mRN,A表達。采用超聲觀察術(shù)前及術(shù)后左心室射血分數(shù)(INEF)的變化。利用倒置顯微鏡觀察BMSCs的生長形態(tài);用熒光顯微鏡觀察DAPI標記的移植細胞在體內(nèi)的存活情況;利用透射電鏡觀察經(jīng)5-氮胞苷誘導后體外培養(yǎng)4周的BMSCs超微結(jié)構(gòu)。

7、采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以均數(shù)±標準差(x-±s)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,均數(shù)比較采用LSD檢驗,相關性采用Pearson相關性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:通過密度梯度離心法和貼壁法獲得BMSCs形態(tài)均一,純度較高。BMSCs經(jīng)5-氮胞苷誘導后細胞形態(tài)變長,體積增大,增殖速度減慢,大約14天左右能見到趨于融合的多核細胞結(jié)構(gòu)。透射電鏡觀察經(jīng)5-氮胞苷誘導4周的BM

8、SCs為BMSCs和肌細胞特點間的過渡類型細胞,可見到微肌絲樣結(jié)構(gòu),但是未發(fā)現(xiàn)肌小節(jié)樣結(jié)構(gòu)。心臟超聲檢查,在AMI前,三組間家兔的左室血分數(shù)(LVEF)差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。在AMI后7天時,對照組、AMI組和BMSCs組的LVEF分別為67.88±3.91％;53.63±3.38％;51.50±3.51％(F=48.836,P=0.0001),AMI組和BMSCs組的LVEF值比對照組降低,差別有顯著性統(tǒng)計學意義。AMI組

9、和BMSCs組的組間LVEF值差異無統(tǒng)計學意義。在BMSCs心臟移植后4周時,與AMI組比較,BMSCs組的LVEF有顯著改善(F=42.769,P=0.0001)。用熒光顯微鏡可觀察到BMSCs移植組心肌內(nèi)有DAPI標記的陽性細胞。GAPDH、RyR2和FKBP12.6的實時熒光定量PCR擴增曲線和溶解曲線說明心肌組織中均有GAPDH、RyR2和FKBP12.6 mRNA的表達。與對照組比較,AMI組梗死邊緣區(qū)心肌的RyR2 mRNA

10、和FKBP12.6 mRNA表達量減少,分別減少1.97倍(P＜0.05)和減少4.41倍(P＜0.05);與AMI組比較,BMSCs組RvR2 mRNA增加1.81倍(P＜0.05),FKBP12.6mRNA增加2.75倍(P＜0.05),LVEF與RyR2和FKBP12.6mRNA均具有正相關性,相關系數(shù)r分別為0.824和0.778,P均＜0.05,有統(tǒng)計學意義,決定系數(shù)R2分別為0.679和0.606。
　　 結(jié)論:經(jīng)5